糖尿病肾病足细胞损伤机制的研究进展

王 娜，邹大威

(1.首都医科大学，北京100069； 2.首都医科大学中医药学院，北京100069)

糖尿病肾病是糖尿病的慢性微血管并发症之一。在我国，30%～50%的糖尿病患者合并有肾病[1]。早期糖尿病肾病的特征是微量白蛋白尿,并逐步进展至大量白蛋白尿，以及血清肌酐和尿素氮水平升高，最终进展为肾衰竭。患者一旦发生肾衰竭则需要行透析或肾移植治疗。临床上，有效的干预措施能防止或延缓糖尿病肾病的进展，因此研究糖尿病肾病的发病机制是极为必要的。研究表明，肾小球滤过屏障的组分之一——足细胞数量减少、结构或功能完整性破坏与蛋白尿的产生存在相关性[2]。因此，研究足细胞的损伤机制可能为糖尿病肾病的干预治疗提供新思路。现就糖尿病肾病中足细胞损伤的机制进行综述。

1 氧化应激

早在2001年，Brownlee[3]就提出氧化应激是糖尿病及其并发症的共同病机。在高糖刺激下，细胞会生成大量晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGEs)，并在细胞内部不断聚积。在AGEs产生过程中，线粒体还会释放大量的活性氧类(reactive oxygen species,ROS)，过量的ROS打破机体氧化体系与抗氧化体系的平衡，损伤细胞。氧化应激可直接导致足细胞凋亡，或通过重排肌动蛋白、增加内皮素-1合成、改变微血管通透性最终导致足细胞损伤。

1.1氧化应激直接导致足细胞凋亡 细胞色素C从线粒体转移至细胞质是细胞凋亡的关键步骤[4]。ROS可通过氧化心磷脂，降低心磷脂对细胞色素C的亲和力，促进细胞色素C与线粒体内膜分离，并释放至细胞质。细胞色素C进入细胞质后与细胞质中的凋亡激活因子-1结合，促进凋亡激活因子-1寡聚化。凋亡激活因子-1可募集caspase-9并形成凋亡小体，最终导致足细胞凋亡。抑制线粒体氧化损伤和细胞色素C释放，消除线粒体ROS，可阻止细胞凋亡途径的激活和足细胞损伤[5]。慢性肾病常伴有高脂血症，ROS过量生成与脂质代谢紊乱共同参与了糖尿病肾病肾功能损害的进程[6]。棕榈酸可促进线粒体产生ROS，过量的ROS通过线粒体凋亡途径参与氧化应激导致的凋亡。若用线粒体抗氧化剂预处理足细胞，而后再加入棕榈酸，线粒体积累的ROS以及足细胞凋亡显著降低[7]。

1.2氧化应激间接导致足细胞损伤 ROS是足细胞中肌动蛋白丝分布和凋亡的重要介质[8]。肌动蛋白丝是细胞骨架的主要成分，用于维持足细胞足突的完整性。ROS水平升高诱导足细胞肌动蛋白重排，足突融合，最终导致肾小球滤过屏障功能障碍，这可能是脂质过氧化过程中形成的脂质自由基导致的[9]。纤溶酶原诱导的线粒体ROS可通过促进足细胞合成内皮素-1，诱导足细胞损伤。使用线粒体ROS选择性抑制剂可阻止纤溶酶原对内皮素-1合成的促进作用[10]。当氧化应激导致线粒体产生的ROS增加时，自由基会诱发DNA链断裂，从而激活核中的DNA修复酶，导致3-磷酸甘油醛脱氢酶的活性受到抑制，AGEs受体表达增加，最终导致细胞损伤[11]。AGEs可通过提高血管内皮生长因子的表达而导致蛋白尿。在体外足细胞实验中，高糖条件下血管紧张素Ⅱ的表达增加，血管紧张素Ⅱ通过作用于血管紧张素Ⅱ受体，刺激内皮生长因子表达[12]。AGEs可导致血管紧张素Ⅱ受体表达上调[13]，使细胞能够更好响应血管紧张素Ⅱ的刺激，提高内皮生长因子的表达量。一氧化氮合酶缺陷会导致氧化应激水平升高[14]。可能的机制是一氧化氮合酶缺陷导致具有舒张血管效应的NO合成不足，使得血管不能有效对抗血管紧张素Ⅱ的作用，导致内皮生长因子途径中的负调节活性丧失，氧化应激水平升高。

2 微RNA

微RNA(microRNA,miRNA)是一类在细胞内普遍存在的内源性非编码小分子RNA，长度为21～24 bp，可通过阻滞蛋白质翻译或诱导信使RNA裂解等发挥转录后调控基因表达的作用。miRNA并非通过单一途径影响特定靶基因，而是可以改变大量靶基因的表达，影响疾病进程。与糖尿病肾病足细胞损伤相关的miRNA可分为两类，一部分miRNA的表达量随糖尿病肾病的发展而下降，提示这部分miRNA的高表达具有肾脏保护作用；而另一部分miRNA在高糖条件下表达上调，加重肾脏损害，提示其高表达具有损伤肾脏的作用。高糖条件下表达下调导致足细胞损伤的miRNA主要包括miR-125、miR-30、miR-346、miR-34c，表达上调加重肾损害的miRNA包括miR-195、miR-21、miR-155、miR-27a。

2.1miRNA表达下调导致足细胞损伤 在高糖诱导的足细胞损伤模型中，miR-125表达下调可导致细胞凋亡，其机制与负性调控p38促分裂原活化的蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinases,p38MAPK)及p38MAPK磷酸化蛋白表达,进而激活SIRT1-P53通路有关；同时，高表达miR-125能有效抑制高糖诱导的足细胞凋亡，其机制与阻断SIRT1-P53通路有关[15]。以上研究证实了miR-125在糖尿病足细胞损伤中的调控作用。

miR-30家族对足细胞的结构和功能稳态至关重要，其表达量的下调会导致足细胞损伤。高糖条件下，miR-30d启动子因受转化生长因子-β (transforming growth factor β，TGF-β)的负性调控，导致miR-30家族的表达显著下调[16]。高表达miR-30a的人足细胞可抵抗损伤因素的刺激[17]，其是通过抑制足细胞上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)实现的[18]。

在高糖条件下,同样能够抑制EMT的miR-346的表达量也明显降低。miR-346对EMT的抑制作用是通过抑制糖原合成酶激酶-3的合成实现的[19]。足细胞发生EMT后会获得活动性，从肾小球基底膜脱落，加重蛋白尿。使用高糖刺激足细胞会导致miR-34c的表达量显著降低，过表达的miR-34c可显著降低Notch1和Jagged1的信使RNA水平，从而抑制足细胞凋亡[20]。

2.2miRNA表达上调导致足细胞损伤 高糖条件下培养的足细胞中miR-195的表达上调，miR-195通过级联反应下调凋亡抑制基因Bcl-2的表达[21]，最终导致足细胞凋亡。miRNA-阵列分析显示，与健康对照组相比，2型糖尿病模型小鼠血浆miR-21的水平明显升高[22]，且miR-21的水平与2型糖尿病小鼠的蛋白尿程度相关[23]。miR-21在足细胞中的过表达可促使足细胞去分化，并增加足细胞的迁移；抑制miR-21的表达可减少足细胞迁移。miR-21是通过激活Wnt/β-catenin通路中的关键因子β-catenin，上调TGF-β1/Smads通路中TGF-β1和P-Smad3的水平，并降低Smad7的水平，促进足细胞的去分化，使足细胞发生EMT[24]。miR-21增加足细胞的迁移能力则是通过影响张力蛋白同源物实现的[23]。

Nephrin是一种上皮标志物，同时也是足细胞的骨架结构蛋白，参与肾小球足细胞中细胞-细胞黏附，并且是信号转导的细胞表面受体，其崩解会导致蛋白尿[25]。与对照组相比，由链脲佐菌素诱导的糖尿病野生型C57小鼠中miR-155的表达显著增加，而足细胞nephrin和乙酰化nephrin的水平则降低[26]；而采用链脲佐菌素诱导的糖尿病miR-155-/-小鼠与野生型相比，尿蛋白排泄显著降低，足细胞损伤标志物desmin的表达也显著降低，而nephrin、乙酰化nephrin以及WT-1的水平则升高[26]。该研究证实，miR-155表达的升高使nephrin以及乙酰化nephrin的水平降低，导致糖尿病肾病的肾损伤。miR-27a表达的上调会导致内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)和足细胞损伤，其是通过负向调控叉头框蛋白O1的表达，并激活ERS实现的。使用miR-27a抑制剂可发现高糖培养条件下的足细胞中叉头框蛋白O1的表达上调，ERS相关分子C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)和葡萄糖调节蛋白78的表达下调，氧化应激减弱[27]。

3 自 噬

自噬现象存在于正常状态人的足细胞中，且一定水平的自噬对维持人足细胞的结构、功能以及代谢稳态有重要作用[28]。自噬异常会导致糖尿病肾病蛋白尿进展[29-30]。多种信号转导通路参与足细胞自噬的调节，目前研究主要集中在哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、AMP活化的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)、沉默信息调节因子-1(sirtuin 1，SIRT1)3个信号通路。

3.1mTOR通路 细胞自噬与凋亡是一个动态平衡的过程，其中mTOR通路是两者共同的中枢。与营养相关的细胞自噬在足细胞损伤中发挥了重要作用。mTOR是自噬的负性调控因子[31]。AGEs能促使人足细胞中mTOR的活化，抑制转录因子EB的核转位，下调自噬相关基因的表达，从而抑制足细胞中自噬体的形成，同时增加足细胞的早期凋亡和晚期凋亡[32]。高迁移率族蛋白-1可通过抑制Akt/mTOR通路，减少足细胞自噬[33]。Pim1-p21-mTOR信号轴对足细胞自噬也有影响。Pim1参与调节自噬相关蛋白(autophagy-related protein，Atg)p21的降解[34]。Pim1抑制剂可调控mTOR的表达,激活足细胞的自噬[35]。足细胞的保护性自噬减少，足细胞凋亡增加，这可能是导致糖尿病肾病肾脏损伤的原因之一。氨基酸信号是自噬调节的重要上游信号。氨基酸饥饿增加了自噬体数量，抑制了mTOR的活性，增加了转录因子EB的活性，而抑制转录因子EB可阻断氨基酸饥饿诱导的自噬[36]。以上研究表明，氨基酸饥饿可通过抑制mTOR通路和活化转录因子EB介导足细胞自噬。

3.2AMPK通路 AMPK作为代谢传感器发挥作用，协调细胞在各种器官(包括肾脏)中的存活和功能。AMPK可以磷酸化TSC2丝氨酸残基1 387位点，激活其复合物的GAP活性，从而使哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体1(mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1)失活。 mTORC1可通过Ser 317和Ser 777位点的磷酸化直接激活UNC-51样激酶1，并加强UNC-51样激酶1与AMPK的相互作用，最终引发自噬[37]。SIRT1是可以调节代谢和细胞存活的脱乙酰酶。AMPK可通过AMP/ATP的变化感知细胞的能量变化，当比值升高时，即胞内能量处于低水平时，AMPK激活。AMPK活化后可直接激活Atg1，也可通过抑制mTOR的活性调节自噬。高糖环境下培养的足细胞中AMPK的表达减少，而应用AMPK激动剂能改善高糖对肾脏的损伤[38]，提示糖尿病环境下足细胞AMPK失活，而激活AMPK能改善AMPK对自噬的调节。在营养缺乏等应激状态下，机体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸/还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸比例升高提示能量不足，Sirt1被激活[39]，Sirt1能通过促进自噬体的形成，促进足细胞自噬[40]。

3.3SIRT1通路 SIRT1通过去乙酰化Atg，如Atg5、Atg7、Atg8以及叉头蛋白转录因子3a，在细胞中发挥效应[41]。在Sirt1敲除小鼠中可发现足细胞自噬受到抑制[42],证明Sirt1起到正向调控自噬和抗细胞凋亡的作用。

3.4其他 长链非编码RNA也可通过调控足细胞自噬参与疾病进程。长链非编码RNA表达的失调参与了多种人类疾病的发生和发展，但目前对于长链非编码RNA在糖尿病肾病进程中的作用尚不明确。有研究发现，长链非编码RNA可通过调节足细胞自噬参与疾病进程[43]。Gm5524在响应糖尿病肾病时显著上调，而Gm15645则在响应糖尿病肾病时显著下调。在高糖培养条件下，Gm5524的敲低和Gm15645的过表达降低了足细胞的自噬，并诱导小鼠足细胞凋亡[44]。长链非编码RNA对足细胞自噬的影响还可通过调节ERS实现。实验证实，长链非编码RNA TUG1可通过ERS-CHOP-过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α通路实现足细胞自噬的调控[45]。用高糖处理后，足细胞内TUG1的含量明显升高，而过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α和裂解的caspase-3的含量降低，CHOP的表达升高，足细胞ERS的水平提高，细胞凋亡减少[45]。

除上述机制外，醛固酮/盐皮质激素受体也可诱导足细胞自噬[46]。此种自噬的调控方式还受ERS和氧化应激的影响。ERS增加了自噬的形成，可保护足细胞免于凋亡。氧化应激则是先通过激活ERS，然后触发CHOP依赖性细胞凋亡和自噬。血红素加氧酶-1也可激活足细胞的自噬途径[47]。虽然此方向研究较少，但也为糖尿病肾病的治疗提供了一个新思路。

4 外泌体

高糖可诱导肾小球内皮细胞EMT，经EMT的细胞可通过释放含有TGF-β1的外泌体刺激足细胞的EMT，并导致足细胞的损伤和功能障碍。肾小球内皮细胞产生的外泌体可被足细胞内化。采用经过EMT的肾小球内皮细胞分泌的外泌体处理足细胞，足细胞的上皮标志物丧失，并获得间充质标志物，这证明足细胞发生了EMT[48]。进一步研究发现，经外泌体处理的足细胞，足细胞EMT的强诱导剂TGF-β1信使RNA的表达水平升高，并激活了Wnt/β-catenin信号通路，最终诱导了足细胞的去分化，导致细胞骨架解体，足突消失[48]。

5 展 望

糖尿病肾病足细胞损伤机制主要是划分为氧化应激、自噬、miRNA三大部分，当前研究比较热门的是自噬、miRNA。近年来，有许多与足细胞损伤密切相关的起到调控作用的miRNA相继被发现，这为进一步阐明足细胞的损伤机制奠定了基础。除了上述研究方向外，国内也有团队创新性地将外泌体纳入了损伤机制的研究范围，并取得了进展；关于长链非编码RNA对足细胞损伤的影响亦是一个新兴研究方向。

糖尿病肾病的作用机制是多重且复杂的，就目前对足细胞损伤机制的研究结果很难说明是哪一种因素在导致糖尿病肾病的发生以及发展中起决定性作用，将来或许需要转变思路，打破固有的从单方面研究足细胞损伤机制的思维方式，从整体层面去研究其机制，这可能有助于更深刻地理解糖尿病肾病中足细胞的损伤机制。在已有的研究中，关于氧化应激、外泌体、miRNA、长链非编码RNA以及自噬相互作用的研究较少，或可作为未来研究的方向。