液体发酵桑黄总黄酮对抗肿瘤活性及细胞周期的影响

黄罗丹，安春艳，刘德阳，潘裕添

(闽南师范大学 菌物产业工程技术中心，福建 漳州363000)

桑黄是一种中国的传统药用真菌，自古以来被奉为珍稀药材。近几十年来，国内外科学家们在桑黄的人工栽培技术、生物学特性研究、药理活性研究等方面开展了广泛的研究[1]。现今已成为国际上公认的癌症治疗领域中药效最为显著的抗癌真菌之一[2-3]，其抗癌效果显著高于灵芝、阿加里斯茸等同类真菌[4]。但桑黄抗肿瘤的物质基础尚未定论。本研究从液体发酵培养的桑黄菌落中提取得到总黄酮，对其药物毒性以及抗肿瘤活性进行检测。

1 材料与方法

1.1 菌种来源

桑黄菌菌株(由闽南师范大学菌物产业工程中心提供)，经鉴定为火木层菌属。

1.2 试剂

麦芽浸粉(天津化学试剂厂)；乙酸乙酯(天津永大试剂厂)；甲醇(山东禹王试剂厂)；胎牛血清(南美PAN Biotech)培养基(MEM1640，美国Gibco公司)；胰蛋白酶，MTS(Amresco)。

1.3 细胞

小鼠成纤维细胞L929，人肝癌细胞HepG-2，上述细胞均由闽南师范大学菌物工程产业技术中心提供。

2 体外抗肿瘤实验

2.1 桑黄菌总黄酮的制备

液体发酵培养桑黄菌20 d，用乙酸乙酯萃取发酵液，反复3次。将萃取物低温旋转蒸发器中蒸发至恒重，得到粗提物。菌丝体加入甲醇，超声破碎，滤去固体后液体同用上述方法萃取，液体蒸发至恒重。产物用1∶1比例的氯仿∶甲醇洗出，再次蒸发至恒重，得到粗提物。滤液回收乙醇至无醇味后，分次加到AB-8 大孔树脂柱上[5]。2 倍柱体积的超纯水洗涤，洗涤液弃去。继续用5 倍柱体积的体积分数70% 乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，减压干燥，粉碎，得桑黄总黄酮[5-6]。

2.2 样品溶液的制备

黄酮溶液的制备：用胎牛血清体积浓度为10%的1640完全培养基稀释以DMSO溶解的总黄酮配置成100 μg/mL的黄酮溶液，使溶液最后DMSO体积占比为黄酮溶液总体积的0.1%，再经0.22 μm微孔过滤器过滤除菌。实验梯度分别设为10 ,20,50,100 μg/mL，使用时用1640培养基稀释[7]。

2.3 MTS法检测细胞活力

细胞培养：用胎牛血清体积10%的1640完全培养基传代培养，将培养至处于对数生长期的细胞用体积浓度0.25%胰酶消化下来，加培养基终止消化后1000 r/min，离心5 min去除胰酶影响，加入适当培养基调整细胞浓度至30×104个/mL，配制成细胞悬液。按1 mL/皿的量接种于直径9 cm塑料培养皿中，放入37 ℃，5% CO2培养箱培养24 h后，分别用浓度为10 μg/mL，20 μg/mL ，50 μg/mL，100 μg/mL的黄酮样品溶液10 mL进行换液，以体积浓度为10%的1640完全培养基作为空白对照，各3个重复。

2.4 总黄酮对细胞的毒性测定

将培养至处于对数生长期的L929、HepG-2细胞用体积浓度0.25%胰酶消化下来，加培养基终止消化后1000 r/min，离心5 min去除胰酶影响，加入适当培养基调整细胞浓度至5×104个/mL，配制成细胞悬液。以每孔100 μL接种量均匀接种于96孔板中，静置30 min，保证细胞均匀沉淀。将孔板放入37 ℃，5% CO2培养箱培养24 h。将96孔板中旧液去除，加入200 μL的总黄酮样品溶液，分别设置浓度为0 μg/mL，10 μg/mL，50 μg/mL，100 μg/mL，每组8个重复，以仅加药但无细胞组作为背景对照，继续培养。分别取24 h，48 h和72 h定时测量。测量前每孔中加入20 μL的MTS，放入37 ℃，5% CO2培养箱继续培养4 h，然后在波长490 nm处用酶标仪进行测量[6-8]。

相对生长率计算公式：RGR值=A样品组*100%/A样品空白组。

1) 总黄酮对HepG-2细胞的细胞形态影响。分别选择24 h，48 h，72h的空白组和加药组的细胞拍照，统一放大倍数为100倍。

2) 总黄酮对肿瘤细胞周期的影响。将培养至对数生长期的细胞用体积浓度0.25%胰酶消化下来，加培养基终止消化后1000 r/min，离心5 min去除胰酶影响，加入适当培养基调整细胞浓度至30×104个/mL，配制成细胞悬液。按1 mL/皿的量接种于直径为9 cm塑料培养皿中，加入9 mL的体积浓度10%的1640培养基，摇匀，放入37 ℃，5% CO2培养箱过夜培养。将培养皿中旧液去除，每皿加入10 mL 的含总黄酮的10%的1640稀释的样品溶液，设置浓度为0 μg/mL，10 μg/mL，50 μg/mL，100 μg/mL，每个浓度3个重复，放入37 ℃，5% CO2培养箱继续培养24 h后定时测量。每皿测量前需要用体积浓度0.25%胰酶消化下来，加培养基终止消化后1000 r/min，离心5 min去除胰酶影响，冰PBS洗3遍，转入1.5 mL EP管中，加入70 %乙醇将细胞沉淀吹打均匀后-20 ℃ 固定4 h，离心去除固定液，再加入999 μL 冰PBS将细胞沉淀吹打均匀后加入1 μL DAPI染料，避光浸染5 min，37 ℃。上样，用流式细胞仪测量，进行数据分析[9-11]。

3 体外抗肿瘤实验结果

3.1 MTS细胞毒性检测结果

不同质量浓度(0 μg/mL，10 μg/mL，50 μg/mL，100 μg/mL)的桑黄总黄酮分别作用于L929和HepG-2细胞24h后，使用酶标仪检测其吸光度值。结果显示，随着桑黄黄酮浓度的梯度增加，L929正常细胞未发生分化，且各个浓度药物对其细胞活力无明显抑制作用；而HepG-2细胞在C组和D组浓度出现细胞形态的变化，细胞总活力随药物浓度的升高呈梯度降低趋势。这表明总黄酮在各实验组质量浓度的药物下对正常细胞的细胞活力无明显抑制作用，而高浓度的剂量条件下(50 μg/mL，100 μg/mL)对HepG-2肿瘤细胞会促进其细胞形态分化，抑制其细胞增殖，如图1—图3所示。

(a)对照组 (b)10 μg/mL总黄酮组

(c)50 μg/mL总黄酮组 (d)100 μg/mL总黄酮组图1 不同浓度桑黄总黄酮对HepG-2细胞形态影响Fig.1 Effect of different concentrations of total flavonoids on cell morphology

用不同浓度的桑黄总黄铜样品溶液分别培养HepG-2细胞24 h，48 h，72 h，其细胞状态与空白组对照存在差异， 图1(a)与图1(b)箭头所指细胞形态未发生改变，随着培养时间的增长细胞数量逐渐增多以及浓度的增大，图1(c)和图1(d)图细胞形态由开始的多边形逐渐生长至有狭长的触角生成的条状，基本没有死细胞漂浮。

图2 不同质量浓度总黄酮对L929细胞的毒性检测结果Fig.2 Toxicity of different concentrations of Total flavonoids to L929 cells

图3 不同质量浓度总黄酮对HepG-2细胞的毒性检测结果Fig.3 Toxicity of different concentrations of total flavonoids to HepG-2 cells

图2和图3中对照组均为药品作用浓度为0 μg/mL时所测量的吸光度比值。*代表ρ<0.05，**ρ<0.01，***ρ<0.001。

3.2 不同质量浓度桑黄总黄酮对L929、HepG-2细胞周期影响实验

不同质量浓度的桑黄总黄酮分别作用于L929和HepG-2细胞24 h后，采用流式细胞仪分析其周期[12-13]。结果显示，随着桑黄黄酮浓度的增加，L929细胞的细胞周期总体不同时期细胞比例大致相同，不随总黄酮浓度的上升而发生改变；反之，HepG-2细胞的G1期细胞总比例随黄酮浓度的增加而逐渐减少，S+G2期细胞总比例随浓度依赖性上升；表明桑黄总黄酮在实验组的质量浓度下对于正常细胞的周期无阻滞作用，对于肿瘤细胞HepG-2的S+G2期有阻滞作用。不同质量浓度桑黄总黄酮作用于L929和HepG-2细胞的周期影响见表1,表2及图3和图4。

表1 流式细胞仪检测L929细胞周期

表2 流式细胞仪检测HepG-2细胞周期

(a)对照组 (b)10 μg/ml总黄酮组 (c)50 μg/ml总黄酮组 (d)100 μg/ml总黄酮组图4 不同质量浓度桑黄总黄酮对L929细胞的周期影响Fig.4 Effects of flavonoids from Phellinus igniarius with different concentrations on the cycle of L929 Cells

(a)对照组 (b)10 μg/ml总黄酮组 (c)50 μg/ml总黄酮组 (d)100 μg/ml总黄酮组图5 不同质量浓度桑黄总黄酮对HepG-2细胞的周期影响Fig.5 Effects of flavonoids from Phellinus igniarius with different concentrations on the cell cycle of HepG-2 Cells

4 结束语

在近几年的实验研究以及医学治疗中，药用真菌桑黄已经越来越多地被应用于抗肿瘤方面，作为化疗药物而使用。其主要抗肿瘤有效成分多糖和黄酮在癌症中的作用机制，以及如何增强机体免疫力的原理，现今仍缺乏强有力的研究数据。据科学研究表明，桑黄的黄酮能够直接作用于HepG-2肿瘤细胞，抑制其增殖，并能够调节机体免疫力，从而间接达到抗癌作用。本研究显示，使用L929正常细胞与HepG-2肿瘤细胞在相同的药物和质量浓度条件下，桑黄总黄酮具有体外抗癌作用，并且具有剂量依赖性。本次实验所用的最大质量浓度100 μg/mL对于正常细胞无明显毒性作用，在剂量安全性范围内。而桑黄总黄酮抑制细胞的机制可能与阻滞肿瘤细胞的细胞周期S+G2期有关。