制药废水厂抗性基因和微生物群落相关性研究

罗 晓袁立霞张文丽钟为章蒋永丰张 迎徐东升



制药废水厂抗性基因和微生物群落相关性研究

罗 晓1,2,袁立霞2,张文丽2,钟为章1*,蒋永丰2,张 迎2,徐东升2

(1.河北科技大学环境科学与工程学院,河北 石家庄 050018；2.河北科技大学建筑工程学院,河北 石家庄 050018)

以2座制药废水厂的生物曝气阶段为例,结合Miseq测序分析技术和荧光定量PCR技术研究活性污泥中微生物群落和β-内酰胺类抗性基因的分布特征、扩增情况及其相关性. 结果表明:β-内酰胺类抗性基因OXA-1、OXA-2和OXA-10在2个水厂(J厂和K厂)中均能被检出,OXA型基因丰度在K厂中为5.82×105~3.94×107copies/g(干重),在J厂的丰度范围为4.84×107~1.09×1010copies/g,3种基因丰度在曝气处理中显著扩增. Miseq测序结果表明:K厂中主要优势菌门为Proteobacteria,Planctomycetes,Bacteroidetes,Chloroflexi和Acidobacteria等,总平均相对丰度比例为82.13%;J厂中主要优势菌门Proteobacteria, Bacteroidetes, Verrucomicrobia, Gemmatimonadetes和Thermi,总平均相对丰度比例为85.76%.冗余分析显示:生物群落中、和等菌属可能是OXA-1、OXA-2和OXA-10的主要携带菌属;、和e可能是OXA-1的主要携带菌属,、和可能是OXA-10的主要携带菌属.

β-内酰胺类抗性基因；荧光定量PCR；Miseq；微生物群落结构

近些年,抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes,ARGs)和抗生素抗性细菌(antibiotic resistance bacteria,ARBs)被认为可能成为一种新型的环境污染物,其风险比抗生素药物本身的污染风险更高[1],关于其行为特点和传播途径的研究也日益增加.抗生素抗性细菌对抗生素的耐药性机理包括:细菌外膜不渗透性障碍、细菌外排泵系统、抗生素作用的靶位变化和抗生素的钝化失活等[2].抗性基因是抗性菌具有抗性的主要原因之一,它可以通过多种形式的可移动遗传元件如质粒、整合子、转座子、插入序列等,突破细菌的种属关系广泛传播,加重抗性污染[3].并且碳青霉烯类抗生素耐药肠杆菌科细菌患病率上升迅速[4],这将对环境和人类健康构成严重的威胁[5-6].

荧光定量PCR技术为研究环境中抗性基因和抗性微生物分布特征提供了有力的手段[7].已有研究表明制药废水处理系统的进水中往往含有高浓度的抗生素及生产原料和中间体[8],对生物处理单元的微生物群落形成高强度选择性压力,为ARGs在污水中的持久存在和传播扩散提供了有利条件,并且制药废水处理系统的出水中ARGs的浓度高于市政污水处理系统的出水[9-10].已有研究表明β-内酰胺类抗性基因广泛存在于河流[11]和污水厂中[12],例如TEM-1广泛存在于医疗废水[13],污水厂[12],河流中[5].Yang等[14]发现在不动杆菌()中检测到β-内酰胺类OXA型抗性基因.Zhang等[15]对东亚以及北美的15家污水处理厂的水质进行了调研,检测出了多种β-内酰胺抗性基因如OXA-1、OXA-2、OXA-10、AmpC和TAM-1.Wang等[16]发现OXA-1和OXA-10型抗性基因广泛存在于以CASS, MBR, EAAS, CAS, A2O等为主要处理工艺的制药废水处理厂,且检出频率为100%.抗生素废水有机物浓度较高,成分复杂,难于处理,目前主要关注的是抗生素和相应抗性基因的相关性研究,缺乏抗性基因在降解过程中微生物群落和其相关性分析的深入研究.

本文选取两座制药废水处理厂中生物曝气阶段为研究对象,利用Illumina MiSeq测序技术和荧光定量PCR技术,解析制药废水厂生物曝气阶段活性污泥中β-内酰胺类抗性基因和微生物群落结构在生物曝气处理过程中的分布规律,并确定活性污泥中土著β-内酰胺类抗性基因和微生物特定菌属的相关性,以期为评估废水处理厂抗性基因和抗性菌环境风险提供依据,并制定有效的控制ARGs和ARBs的传播策略.

1 材料与方法

1.1 样品采集

河北省某头孢类制药废水处理站(K厂),该厂设计水量500m3/d,主要采用活性污泥法处理头孢类生产废水,污水处理流程为:调节池-一级曝气池-初沉池-二级曝气池-二沉池.样品采用500mL聚乙烯瓶,于2017年10月,采集不同污水处理单元活性污泥样品,分别标记为G(调节池)、D(一级曝气池)、B(初沉池)、A(二级曝气池)、C(二沉池);河北省某制药厂(J厂),该厂设计水量300m3/d,用500mL聚乙烯瓶,于2018年1月,采集曝气池(HB)和沉淀池(HC)中活性污泥.取样结束后,于冰盒中运送回实验室,离心(5min,11000r/min)后称取5g冷冻于-80℃冰箱中,以备DNA提取.具体样品编号及采样信息见表1.

表1 两制药废水厂样品和相关水质信息

1.2 水样分析

按照《水和废水监测分析方法》[17]国家标准方法分析常规化学指标,测定水中CODcr和氨氮,测定均有3个平行,最后计算平均值.

1.3 DNA提取及PCR的扩增

DNA提取采用PowerSoil®DNA Isolation Kit试剂盒,按照试剂盒流程提取DNA.以所提取各样品DNA为模板,对其16S rDNA V4区进行扩增.反应体系为30μL,上游引物为520F(5'-AYTGGGYD- TAAAGNG-3'),下游引物802R(5'-TACNVGGGTA- TCTAATCC-3').PCR扩增管中添加DNA模板0.5μL,正反向引物各0.6μL,灭菌水22.4μL,dNTP2.4μL,3μL缓冲液,ExTap酶0.5μL.PCR反应程序:先94℃预变性10min,然后进行30个循环(94℃变性1min,55℃退火1min,72℃延伸1min),最后72℃延伸10min.

扩增结束后,运用1％琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测,使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN)切胶回收DNA.PCR扩增后的条带亮度明显,位置清晰,可直接用于后续测序分析.委托北京理化分析测试中心进行Illumina MiSeq高通量测序.

1.4 抗性基因的定性检测

采用PCR方法检测β-内酰胺类抗性基因OXA-1,OXA-2和OXA-10,所用引物见表2.

抗性基因定性检测反应体系为:10μL Green qPCR Master Mix,0.5μL引物(F),0.5μL引物(R),DNA模板1μL,加灭菌水至20μL.反应程序为:94℃ 5min;94℃ 30s,55℃ 30s,72℃ 5min,并在4℃下保存.每次运行使用无菌水做阴性对照,PCR产物以1%的琼脂凝胶电泳分析.

表2 抗性基因所用的引物序列(参考文献[18])

1.5 抗性基因的定量检测

采用SYBR-Green 实时定量PCR方法对各基因进行定量分析,检测仪器为StepOne型荧光定量PCR仪(ABI,美国).PCR产物经过克隆测序确认后,使用生工质粒提取试剂盒SK1131从阳性克隆子中提取质粒,用作标准曲线.使用NanoDrop微量分光光度计(Thermo Scientific,美国)测定质粒浓度.制作标准曲线时按照10倍梯度浓度稀释构建好的各质粒,于90μL稀释液中加入10μL质粒,做4~6个点,通过预实验选取合适标准品用于制备标准曲线.标准质粒、环境样品、阴性对照均做3个平行,取平均值进行计算.

质粒拷贝数换算公式

=[×10-9×6.02×1023]/[×660] (1)

式中:为质粒拷贝数,copies/μL;为质粒浓度, ng/μL;为克隆产物碱基数,g/mol.

荧光定量PCR反应体系为:12.5µL 2×SYBR, 1.0µL DNA(10ng/μL),0.5µL引物F (10mol/L), 0.5µL引物R(10mol/L),10.5µL水,总体积25.0µL.荧光定量PCR反应程序为:①50℃, 2min;②95℃,5min;③95℃, 20s;④退火,30s;⑤72℃, 31s;⑥Plate read,重复③~⑤,重复39次;⑦Melt-curve分析60~95℃.每隔0.2℃采集1次荧光以生成溶解曲线,根据溶解曲线变化检测扩增结果的特异性.退火温度和反应时间根据引物不同进行调整.

1.6 统计分析

抗性基因浓度结果和群落结构使用OriginPro 8.6软件(Origin Lab Corporation,USA)进行分析;使用MOTHUR软件计算各个样本Alpha多样性指标,以反映本次测序深度、物种均匀性等;使用R软件对样本绘制热图并分析;ARGs与群落结构相关性使用CANOCO 5.0(Microcomputer Power,Ithaca,NY)软件分析.

2 结果讨论与分析

2.1 微生物菌群耐药基因定量检测

利用荧光定量PCR的方法检测β-内酰胺类抗性基因OXA-1,OXA-2和OXA-10在2厂中的分布特征和变化情况,结果如图1所示.

图1 水处理阶段ARGs分布

由图1可见,在K厂中,OXA型基因的丰度范围为5.82×105~3.94×107(单位copies/g,含水率96.32%);J厂中,OXA型基因的丰度范围为4.84×107~1.09× 1010,J厂比K厂的丰度高出2个数量级;且2厂中ARGs丰度沉淀阶段均高于曝气阶段,K厂中沉淀阶段丰度高于曝气阶段的1.03~3.77倍,J厂中沉淀阶段丰度高于曝气阶段的1.57~2.50倍,说明沉淀阶段是富集ARGs的主要阶段;抗性基因OXA-1和OXA-2丰度在2厂中持续增长,OXA-10丰度在K厂中有下降,在J厂中上升;OXA-1在K厂中丰度范围5.82×105~2.91×107,在J厂丰度范围为(4.84~ 7.58)×107;OXA-2在K厂中丰度范围(4.46~3.45)×106,在J厂丰度范围为4.37×109~1.09×1010;OXA-10在K厂中丰度范围2.61×106~3.94×107,在J厂丰度范围为1.04× 108~4.95×109.其中,OXA-10基因丰度在K厂中削减,在J厂中上升,且其余2种抗性基因丰度在2厂均不同程度上升,这和余忻[19]的结果一致,其结果表明污水处理工艺虽可削减污水中耐药乳糖发酵型肠杆菌科细菌数量和耐药基因浓度,但会提高污水中的微生物对抗生素的耐药率,并提高耐药基因在微生物中的丰度,因此曝气处理过程非但不能削减这2种ARGs丰度,反而刺激它大量扩增,是重要的抗性基因污染源头.

2.2 微生物群落多样性分析

为了进一步了解β-内酰胺类抗性基因及微生物群落结构在废水处理过程中的分布和其相关性特征,采用Illumina高通量测序对活性污泥样品中微生物菌群进行多样性分析.

表3 活性污泥中菌群多样性指数

表3为6个样品的Alpha多样性指标.其中, Chao1、Shannon和Simpson指数表明各处理单元细菌群落和物种的多样性,其中丰富度指数Chao1可以估算群落中含OTU数目的指数,在生态学中常用来估计物种总数,值越大代表物种总数越多[20].从该指数来看, K厂中,Chao1指数和ACE指数呈现下降趋势,下降幅度均为33.37%,说明后续处理水质稳定,功能性菌群占据主导地位造成群落结构逐渐集中化;而J厂的Chao1指数和ACE指数在升高,可能是J厂水质成分复杂COD,氨氮较高,菌群多样性较高.

Shannon指数反映了基于物种数量的群落种类多样性,指数越大表明群落的复杂程度越高[21],K厂随着水质好转,指数持续下降,下降的平均幅度为35.15%,J厂中指数升高,可能是水厂运行不稳定导致.Simpson指数体现了优势物种生物量占群落生物总量的比重,该指数越大表明优势菌群生物量占总生物量比重越大,反之则优势菌群生物量占总生物量的比重越小[22],表3中K厂指数先下降后升高,优势菌群生物量所占总生物量比重先下降后升高,J厂指数没有发生变化,优势菌群生物量所占总生物量比重不变.

2.3 微生物菌群结构分析

2.3.1 在门分类水平上分析 利用Miseq高通量测序分析技术在门水平上对测序结果进行归类,分析所取7个污泥样品的菌群组成及相对丰度差异,结果如图2所示.

图2 门水平下微生物群落相对丰度

由图2可见,在门级别,两制药废水厂各样品中(G~HC)共统计到48个菌门.K厂污泥样品中,变形菌门(Proteobacteria),浮霉菌门(Planctomycetes),拟杆菌门(Bacteroidetes),绿弯菌门(Chloroflexi),酸杆菌门(Acidobacteria)等为优势菌门,平均总相对丰度比例占到82.13%,且总体差异较小.K厂主要优势菌门与郑向阳等[23]淀粉污水处理厂和AO反应器的优势菌门种类大致相同,其总相对丰度差异可能是制药废水与淀粉污水在水质水量上的不同导致.在A和C单元中Proteobacteria和Bacteroidetes的相对丰度明显升高,这和康晓荣[24]的研究,Proteobacteria和Bacteroidetes随着总氮和总磷去除率的提高,其丰度也相应增加,具有重要的硝化及反硝化脱氮除磷作用的结论一致.Planctomycetes和Chloroflexi相对丰度逐渐减少;Bacteroidetes相对丰度逐渐升高; Acidobacteria相对丰度基本保持不变在4.60%左右,且5种主要菌门在整个处理流程中占到总相对丰度77.03%~88.41%.J厂污泥样品中,变形菌门(Proteobacteria),拟杆菌门(Bacteroidetes),疣微菌门(Verrucomicrobia),芽单胞菌门(Gemmatimonadetes),栖热菌门(Thermi)等为优势菌门,总平均相对丰度比例占到85.76%.其中J厂的变形菌门在所有活性污泥样品中所占的比例也最多,HB的相对丰度为60.00%,HC的相对丰度为56.55%.

两厂中变形菌门在所有活性污泥样品中所占的比例最多,占每个活性污泥样品细菌总相对丰度的37.66%~63.38%范围内,为主要优势菌门.这与Liu等[25]研究结果一致,其通过构建实验室规模生物造粒流化床反应器对不同时期的微生物群落进行多样性分析,所得的18个分类操作单元中,有11个属于变形菌门,3个属于放线菌门,表明变形菌门在污水处理中属于较优势的细菌类群.说明不仅仅是污水处理,制药废水处理中的优势菌门也为变形菌门.

2.3.1 在属分类水平上分析 在属水平上对样品及其所含菌属进行聚类分析,并根据各样品中不同OTU所含丰度绘制热图,以反映在菌属水平上聚类差异及群落结构差异性,如图3所示.

从总体来看,K厂与J厂在菌群结构上差异性较大,为便于分析,将各样品微生物热图划分为3个Cluster.从Cluster 1和Cluster 2来看,K厂与J厂菌群丰度差异性较大,其中,B和D与其余单元菌属丰度差异性较大,丰度较高的是、、、和等菌类,其中,(硝化螺菌)是活性污泥中起硝化作用的主要菌属之一[26],K厂中丰度较高,反映出K厂脱氮效果强于J厂.A和C单元与其他样品单元差异性较大,差异性较大的菌属为、和等,其中是活性污泥中与反硝化作用有关的菌属[27],在K厂中丰度较高.从脱氮相关菌属丰度可看出K厂较J厂氨氮去除效果好.Cluster 3包含、、、和等菌属,其中,是活性污泥中与反硝化作用有关的菌属[27],在好氧和厌氧的条件下都有良好的脱氮效果[28].

图3 属水平下的前50个物种相对丰度

有研究表明,活性污泥中与反硝化作用有关的主要菌属包括:、、、、和等[27].在本研究中,也发现了、和等可能参与反硝化作用的细菌类群,其相对丰度如表4所示.由表4可知,为J厂中丰度最高菌群,并且(陶厄氏菌属)是主要的反硝化脱氮微生物,在反硝化以及芳香族化合物的降解过程中起了十分重要的作用[29],为K厂丰度最高菌群,且各菌属随水质变化成一定的演替规律.

表4 各样品反硝化相关菌群相对丰度

变化较为明显的是、、、、、a17、等,其中Nitrospira(硝化螺菌)是活性污泥中起硝化作用的主要菌属之一[26];(芽孢杆菌属)为污水厂中广泛存在的菌属[30-31].从Cluster 3来看,1B与1C的相对菌属丰度较高,分别为,,等,其中(生丝微菌属)为病原菌[32],且对污染土壤有较好的修复能力.Cluster 4大部分菌群属于硝化菌、反硝化菌,并且(陶厄氏菌属)是主要的反硝化脱氮微生物,在反硝化以及芳香族化合物的降解过程中起了十分重要的作用[29];(副球菌属)在好氧和厌氧的条件下都有良好的脱氮效果[28].

2.4 微生物群落和抗性基因相关性分析

2.4.1 主成分分析和冗余分析 微生物群落结构会影响ARGs的产生和丰度[14],但是微生物群落结构在环境样本中对ARGs扩增影响的研究还是有限的.通过高通量测序和荧光定量方法来分析污水处理系统中微生物群落和抗性基因分布的相关性.

首先对2座厂的6个样本进行主成分分析(图4a),然后选取COD、氨氮、抗性基因OXA-1, OXA-2和OXA-10作为环境因子,结合各样本微生物群落结构,选取2厂中15种相对丰度较高的菌属作为样本,利用冗余分析(RDA)方法研究微生物与环境因子的相关性,结果见图4b.

对6个样本进行主成分分析,结果(图4a)表明,PC1(主成分1)表示2组间差异中可以解释全面分析结果的85.36%,PC2(主成分2)表示2组间差异中可以解释全面分析结果的12.92%,2点之间的距离越近,表明2个样本之间的微生物群落结构相似度越高,差异越小.从图中可看出3组间应该有明显的差异性,J厂的HC和HB样本单元分布较近,K厂的D和B单元分布较近,其余K厂的A和C单元分布较近,这3组组内的微生物群落结构相似度较高,且每组样本与样本之间的距离呈现一定的变化规律.

a. 样本主成分分析;b. 微生物与环境因子

对6个样本进行冗余分析,结果表明(图4b),主轴1和主轴2共解释了微生物群落结构和水质、抗性基因参数的98.04%,其中,微生物群落中、、以及等菌属与-,-和-3种抗性基因和氨氮呈正相关,、和e等与-抗性基因呈正相关,、和与COD和-呈正相关,和与COD正相关.

在制药废水活性污泥中,Bdellovibrio、KD8-87、Paracoccus以及B-42等菌属可能是-、-和-3种抗性基因的主要携带菌属,、和可能是-的主要携带菌属,其中Guo等[33]从Comamonas sp.GTP4(Comamonadaceae)中检测到-型抗性基因全序列;、、和可能是-分布的主要携带菌属,其中Laviad等[34]从AIMA4 (DSM 19884)(Betaproteobacteria)中检测到-基因的全序列,Amiri等[35]从SWB007(Myxococcales)中检测到-基因的全序列.Ellin6075和Methyloversatilis与COD正相关,可能是这2种菌属较适应有机负荷高的污水.其余菌属可能是未被检测发现,有待进一步研究.

3 结论

3.1 β-内酰胺类抗性基因-,-,-在2个水厂中各个阶段的检出频率均为100%.生物曝气处理过程非但不能削减-和-丰度,反而刺激它大量扩增,是某些抗性基因的重要污染源头.二级曝气处理系统对β-内酰胺类-型抗性基因有一定的去除效果.

3.2 两制药废水厂中,K厂中主要优势菌门为变形菌门(Proteobacteria),浮霉菌门(Planctomycetes),拟杆菌门(Bacteroidetes),绿弯菌门(Chloroflexi),酸杆菌门(Acidobacteria),平均总相对丰度比例占到82.13%.J厂污泥样品中,主要优势菌门为变形菌门(Proteobacteria),拟杆菌门(Bacteroidetes),疣微菌门(Verrucomicrobia),芽单胞菌门(Gemmatimonadetes),栖热菌门(Thermi),总平均相对丰度比例占到85.76%.

3.3 生物群落中、KD8-87、以及B-42等菌属可能是、和3种抗性基因的主要携带菌属,、和可能是抗性基因的主要携带菌属,、、和可能是的主要携带菌属.

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Correlation study between resistance genes and microbial communities in pharmaceutical wastewater treatment plants.

LUO Xiao1,2, YUAN Li-xia2, ZHANG Wen-li2, ZHONG Wei-zhang1*, JIANG Yong-feng2, ZHANG Ying2, XU Dong-sheng2

(1.School of Environmental Science and Engineering, Hebei University of Science & Technology, Shijiazhuang 050000, China；2.School of Civil Engineering, Hebei University of Science & Technology, Shijiazhuang 050000, China)., 2019,39(2)：831~838

The distribution characteristics, amplification and correlation of microbial communities and β-lactam resistance genes in active sludge were studied by Miseq sequencing analysis and fluorescence quantitative PCR. The samples of active sludge were obtained from the biological aeration stages of two pharmaceutical wastewater treatment plant (Plant J and K). β-lactam resistance genes OXA-1, OXA-2 and OXA-10can be detected in both plants. The abundance of OXA gene was 5.82×105~3.94×107copies/g (dry weight) in K plant and was 4.84×107~1.09×1010copies/g in J plant. The Abundance of three genes in aeration treatment is significantly amplified. Miseq sequencing showed that the main dominant bacterium were Proteobacteria, Planctomycetes, Bacteroidetes, Chloroflexi and Acidobacteriain K plant and the total average relative abundance ratio was 85.76%. The main dominant bacterium were Proteobacteria, Bacteroidetes, Verrucomicrobia, Gemmatimonadetesand Thermiin J plant, the total average relative abundance ratio was 85.76%. Redundancy analysis display showed that、andin biological community were the major distribution factors of OXA-1、OXA-2 and OXA-10.、ande were the major distribution factor of OXA-1.、andwere the major distribution factor of OXA-10.

β-lactam resistance genes；fuorescence quantitative PCR；miseq；microbial community structure

X172

A

1000-6923(2019)02-0831-08

罗 晓(1973-),男,广东崖县人,副教授,博士,主要从事水污染控制研究.发表论文50余篇.

2018-07-10

国家自然科学基金资助项目(51708170)

* 责任作者, 讲师, zhongweizhang@aliyun.com