血清白细胞介素-6和白细胞介素-1 β水平在预测依那西普治疗类风湿关节炎患者临床应答中的作用

姜薇，王娟

（江汉大学附属医院 1. 风湿血液内科；2. 内分泌科，武汉 430015）

类风湿关节炎 （rheumatoid arthritis，RA） 是一种以滑膜组织炎症为特征，以慢性多发性关节炎为主要临床表现的系统性自身免疫性疾病［1］。如未能及时治疗，2年致残率可达50%，这不仅严重影响患者的生活质量，同时也给社会带来极大的负担［2］。肿瘤坏死因子抑制剂 （tumor necrosis factor inhibitor，TNFi） 是一类可以特异性拮抗肿瘤坏死因子-α （tumor nectorsis factor α，TNF-α） 的生物制剂，主要包含依那西普 （etanercept，ETN） 、英夫利昔 （infliximab，IFX） 和阿达木单抗 （adalimumab，ADA） ，常用于RA的治疗。临床数据表明，虽然TNFi的使用极大地提高了RA患者治疗转归，然而，依然有20%～30%的RA患者对于TNFi治疗应答不佳或者难以承受其高昂的价格［3］。因此，积极探寻影响TNFi治疗RA患者疗效预测因素，从而进一步促进患者的个体化治疗亟待进行。本研究通过检测基线期血清中8个与炎症调节相关蛋白的表达水平，旨在评估其在预测ETN治疗RA患者临床应答中的作用。

1 材料与方法

1.1 研究对象

本研究为前瞻性队列研究。研究连续纳入58例2015年1月至2016年12月于江汉大学附属医院就诊的活动性RA患者。入组标准为：（1） 符合1987年美国风湿病学会 （American College of Rheumatology，ACR） 的RA分类标准或2010年修订的ACR/欧洲抗风湿病联盟 （European League Against Rheumatism，EULAR） 的RA分类标准［4］； （2） 年龄≥18周岁； （3）28关节疾病活动度 （disease activity score 28，DAS28） ＞3.2分［5］； （4） 准备接受ETN治疗； （5） 研究者判断可定期随访的患者。排除标准为：（1） 6个月内使用过TNFi治疗的患者； （2） 正处于全身急、慢性感染期间，或既往有活动性结核史者； （3） 合并乙肝表面抗原阳性，或丙肝抗体阳性； （4） 合并中重度肝功能异常或肾功能异常； （5） 恶性肿瘤史患者； （6） 中重度心力衰竭史患者 （纽约心脏学会3～4级） ； （7） 孕妇、哺乳期妇女或准备怀孕的妇女； （8） 认知功能障碍等导致无法正常进行问卷评估的患者。本研究已获得江汉大学附属医院伦理委员会批准，所有患者均签署了知情同意书。

1.2 研究流程

本队列研究不干预患者用药方案，患者根据疾病需要和个人意愿选择ETN进行RA的治疗持续6个月。ETN的使用参考2010年中华医学会风湿病学分会《风湿病学诊断和治疗指南》以及《依那西普治疗类风湿关节炎和强直性脊柱炎的专家建议》推荐，并结合临床实际情况进行治疗。ETN常规用法用量为25 mg/次、每周2次或50 mg/次、每周1次，皮下注射。根据患者病情需要，常加用一种缓解疾病抗风湿类药物 （disease-modifying antirheumatic drugs，DMARD） 进行联合治疗，包含甲氨蝶呤 （methotrexate，MTX） 、来氟米特 （leflunomide，LEF） 和柳氮磺胺吡啶 （salazosulfadimidine，SSZ） 。58例患者中，由于疗效不佳，1例于第3月、2例于第5月分别提前退出研究，2例由于肝功能持续升高，于第3月、第4月分别提前退出研究。研究采用意向分析，即提前退出研究的患者按照最后一次随访的数据作为最后研究重点数据进行分析。

1.3 临床信息采集

收集基线期患者年龄、性别、病程、生化指标、疾病评估指标以及合并用药等信息。计算患者每次随访以及终点第6个月时DAS28评分。采用EULAR定义的TNFi治疗RA临床应答标准［6］进行疗效评估，即临床应答定义为经过TNFi治疗后DAS28评分相对于基线期下降≥1.2分。

1.4 样本采集及ELISA检测

所有患者于基线期清晨空腹采集外周血4 mL，进行离心分离，并将血清置于-80℃保存备用。采用酶联免疫吸附测定 （enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA） 试剂盒检测血清中TNF-α （美国Invitrogen公司） 、白细胞介素 （interleukin，IL） -1 β （美国Invitrogen公司） 、IL-6 （美国Invitrogen公司） 、IL-17A （美国Invitrogen公司） 、IL-21 （美国Invitrogen公司） 、IL-34（英国Cambridge公司） 、核因子κ B受体活化因子配体（receptor activator for nuclear factor-κ B ligand，RANKL）（英国Cambridge公司） 和软骨寡聚基质蛋白 （cartilage oligomeric matrix protein，COMP） （美国R&D公司） 表达水平，所有操作严格按照试剂盒说明进行。

1.5 统计学分析

本研究使用SPSS 22.0软件和GraphPad prism 5.01软件进行统计分析。数据采用x-±s、中位数 （四分位间距） 或频次 （百分比） 进行描述。采用Wilcoxon秩和检验对ETN治疗应答组与无应答组基线期血清标志物表达水平差异进行比较分析。利用受试者工作特征 （receiver operating characteristic，ROC） 曲线及曲线下面积 （area under curve，AUC） 评估差异表达血清标志物对ETN治疗RA临床应答的预测作用。采用单元和多元logistic回归模型分析影响ETN治疗RA患者临床应答的因素。P ＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者基线信息

本研究连续纳入的58例RA患者平均年龄为（49.5±10.7） 岁，其中，男17例，女41例，病程中位值为61 （45～72） 个月。RA患者DAS28评分和健康善评定表（health assessment questionnaire，HAQ）评分的均值分别为5.6±1.6和1.8±0.7，46例 （79.3%） 类风湿因子 （rheumatoid factors，RF） 呈阳性，39 （67.2%）例抗环瓜氨酸肽抗体 （anti-cyclic citrullinated peptides，Anti-CCP） 呈阳性。见表1。

表1 RA患者基线信息Tab.1 Baseline characteristics of RA patients

2.2 ETN治疗应答组与无应答组基线血清标志物表达水平

经6个月ETN治疗后，38例RA患者DAS28评分相对于基线期下降≥1.2，符合临床应答标准，划入应答组，其余20例未达到临床应答，划入无应答组。应答组患者基线期IL-1 β （P = 0.011） 和 IL-6 （P = 0.004）水平显著高于无应答组，但2组基线TNF-α （P =0.229） 、IL-17A （P = 0.134） 、IL-21 （P = 0.182） 、IL-34（P = 0.143） 、RANKL （P = 0.909） 和COMP （P = 0.284）水平均无统计学差异。见图1。

2.3 血清标志物在预测ETN治疗临床应答的ROC曲线

采用ROC曲线评估差异表达血清标志物IL-1 β和IL-6对ETN治疗RA患者临床应答的预测作用，基线期血清IL-1 β和IL-6水平均具有较好的区分临床应答和无应答患者的能力，AUC分别为 0.703（95% CI：0.558～0.847） 和0.732（95% CI：0.601～0.862）。见图2。

2.4 基线期预测ETN治疗RA患者临床应答的因素分析

进一步采用单元、多元逻辑回归模型分析基线期特征对ETN治疗RA患者临床应答的预测作用，其中连续变量以中位值为切割点划分高低进行分析。单元逻辑回归结果表明 （表2） ，基线期IL-6高表达（P = 0.031） 和CRP高表达 （P = 0.008） 均可以预测ETN治疗RA患者具有较好的临床应答。将单元回归模型中P ＜ 0.1的因素进一步纳入多元回归模型分析，结果显示，基线期IL-6 （P = 0.031） 和CRP （P =0.012） 高表达均可以独立预测ETN治疗RA患者更好的临床应答。提示IL-6高表达可以独立于CRP预测ETN治疗RA患者临床应答，见表3。

3 讨论

目前研究［7］表明，IL-1 β可以促进RA滑膜细胞和淋巴细胞的增殖和分化，促进滑膜细胞和软骨细胞合成并释放前列腺素E2和胶原酶，从而引发滑膜的炎症反应和软骨机制的崩解，造成关节损伤，同时局部免疫复合物、游离的胶原等分解产物反过来也可以刺激IL-1 β的合成，从而形成一个恶性循环，促进RA的发展。既往研究［8-9］表明，RA患者的血清IL-1 β水平显著高于正常人群，并且与RA患者疾病活动度正相关。然而，IL-1 β是否可以预测TNFi治疗RA患者临床疗效尚有争论。一项瑞典和日本联合进行的队列研究［10］表明，血浆中IL-1 β高水平可以预测患者使用TNFi治疗获得临床应答。然而荷兰一项队列研究［11］却发现，滑膜中IL-1 β表达水平与TNFi治疗RA患者的临床应答无关联。目前IL-1 β在TNFi治疗中国RA患者疗效预测作用研究尚未见报道，本研究发现血清IL-1 β水平在TNFi治疗应答组RA患者中高于无应答组患者，并且ROC曲线表明IL-1 β水平具有不错的区分应答组与无应答组患者的能力。这可能是由于IL-1 β与患者的炎症水平正相关，而高炎症水平患者对于TNFi的强力抗炎作用应答更加明显，也具有更大的DAS28下降阈值。

图1 ETN治疗应答组与无应答组基线血清标志物表达水平的差异Fig.1 Differences in expression of serum baseline markers between ETN-responser and non-responser groups

图2 血清标志物对ETN治疗应答的ROC曲线

IL-6是一种多效性前炎性细胞因子，是造成RA的主要病因之一［12］。既往研究［13］表明，IL-6表达水平在RA患者的关节滑膜、滑膜液和外周血中均显著增加，提示IL-6水平或许可作为RA患者疾病严重程度评估的标记物以及成为RA治疗靶标的潜能。近期IL-6抑制剂 （托珠单抗） 的问世及广泛应用进一步验证了此观点［14］。然而，目前关于IL-6表达水平对于TNFi治疗RA患者临床疗效的影响少有报告。一项日本的队列研究［15］显示，基线期血清IL-6水平可能会预测早期RA患者的骨破坏进展。此外，瑞典和日本联合进行的队列研究［10］表明，血浆中IL-6高水平可以预测患者使用TNFi治疗获得临床应答。目前IL-6在TNFi治疗中国RA患者疗效预测作用研究尚少，本研究发现基线期血清IL-6水平在ETN治疗应答组中显著高于无应答组，ROC曲线分析表明，IL-6水平具有不错的区分应答组与无应答组患者的能力。并且，单元多元逻辑回归分析证明，基线期IL-6高水平是ETN治疗RA患者临床应答的独立预测因素。可能原因为：（1） IL-6高水平与患者炎症高水平相关，而高炎症水平患者对于TNFi治疗的抑制炎症作用应答更加明显，其也具有更大的DAS28下降阈值； （2）IL-6高水平可以激活NF κ B和Wnt等促炎信号通路，进而提高患者对于TNFi治疗的应答。

表2 影响ETN治疗RA患者临床应答因素的单元逻辑回归分析Tab.2 Univariate logistic regression analysis of clinical response factors affecting RA patients on ETN

表3 影响ETN治疗RA患者临床应答因素的多元logistic回归分析Tab.3 Multivariate logistic regression analysis of clinical response factors affecting RA patients on ETN

本研究存在一些不足：（1） 本研究纳入的患者样本量较少，因此可能导致部分分析缺乏统计效能。 （2） 本研究随访时间较短，因此，ETN治疗RA患者长期疗效的预测因素未能评估。 （3） RA患者在接受ETN治疗时，有联合使用MTX、LEF和SSZ，这些混杂因素可能对结果产生干扰，但本研究采用单元、多元逻辑回归分析，减少了这些混杂因素对于结果的影响。

综上所述，本研究表明，基线期血清IL-1 β和IL-6表达水平可能会作为ETN治疗RA患者临床应答的生物标记物。