活性氧及其介导的线粒体损伤在肌萎缩侧索硬化症中的研究进展

安 娜综述，罗 果审校

0 引 言

线粒体是细胞生长、增殖、分化和凋亡等生命活动的调控中心，细胞的生死存亡很大程度上取决于线粒体的功能状态。线粒体不仅是活性氧（reactive oxygen species，ROS）的主要来源，也是其主要作用靶点，ROS 损伤线粒体主要与线粒体呼吸链酶类变化、钙离子超载、线粒体膜电位下降、促细胞凋亡蛋白过表达、线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）开放等因素有关。研究表明多种疾病如神经退行性疾病、糖尿病、癌症等的发病机制都与ROS 介导的线粒体氧化损伤密切相关［1-3］。肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是一种致命的神经肌肉疾病，其发病机制复杂，致病因素包括铜锌超氧化物歧化酶（Cu/Zn SOD1）基因突变、谷氨酸的兴奋毒作用、线粒体功能异常、氧化应激、外源性毒素或病毒感染、免疫炎症、神经微丝的过磷酸化、神经营养因子的缺乏等。从ROS 与线粒体损伤的角度研究ALS 的发生发展机制已经成为国内外研究的重点和热点。

1 ROS的产生与清除机制

在正常生理条件下，ROS 生成与清除之间的平衡受到高度控制。一方面氧化应激可引发多种细胞反应，包括触发细胞保护相关的信号通路、启动线粒体分裂和自噬等，以清除异常线粒体和细胞，避免对邻近线粒体和细胞造成破坏［4-5］。另一方面，失控的氧化应激可能导致严重的细胞损伤和死亡，从而引起整个器官和有机体的衰竭［6-9］。因此ROS产生与清除的稳态是线粒体、细胞和生物体发挥正常功能的关键因素。

1.1 线粒体呼吸链是ROS 的主要来源线粒体是细胞有氧代谢和生成ROS 的主要场所。ROS 主要包括超氧阴离子（O2·-）、过氧化氢（H2O2）、羟自由基（·OH）以及一氧化氮（NO）等。超氧阴离子是ROS的基本形式，其他类型的ROS 可通过超氧阴离子的代谢产生。正常生理状态下，线粒体内膜电子传递链上有一部分电子脱离，大约有1%～2%的氧被还原成超氧化物阴离子。目前研究证实线粒体呼吸链复合物Ⅰ和复合物Ⅲ是ROS 的主要产生位点，复合物Ⅱ能产生部分ROS［10-11］。ROS 介导的线粒体呼吸链复合物I、II、III 的损伤和三羧酸循环的缺陷会导致线粒体功能发生衰退，引起细胞死亡［12］。

1.2 ROS 诱导的ROS 释放在细胞中，ROS 会触发单个线粒体mPTP 开放，诱导更多的ROS 释放，这种触发现象称为“ROS 诱导的ROS 释放”（ROS-Induced ROS Release，RIRR）［13］。ROS 触发mPTP 开放导致ROS 信号进一步放大，释放到细胞质中的ROS 能在邻近的线粒体中触发更为复杂的细胞信号反应和RIRR。在该情况下，线粒体之间的ROS运输形成正反馈机制，导致ROS 的生成进一步增加，这可能引起线粒体和细胞损伤［14］。正常状态下RIRR 可起到天然安全阀的作用，防止ROS 在线粒体内过度积聚，但在氧化应激或病理过程中，RIRR会导致大量ROS 释放，并触发凋亡或细胞内的自噬通路。线粒体RIRR 的机制突出了线粒体生成ROS的中心作用，ROS 水平的高低，直接导致不同的结果［15］。

1.3 Mitoflashes 现象单个线粒体随机、间歇性的生成超氧化物，伴随着线粒体膜电位的短暂去极化和mPTP 的可逆性开放，这种新的ROS 生成模式称为超氧炫或线粒体炫［16］。Mitoflashes 是包括ROS 增加、pH 增加、氧还原电势增加和线粒体膜电位突然丢失等多个层次变化的复合现象，已在不同的组织和细胞中检测到异常增多的Mitoflashes［17-21］。Karam等［17］研究表明，从转cpYFP 基因小鼠分中分离趾短屈肌，失神经组与正常组肌细胞相比mitoflashs 现象增加，证实异常增多的Mitoflashes 可能对肌细胞产生氧化损伤。Mitoflashes 是一种普遍和基本的线粒体活动，发挥着重要的信号作用。Fu 等［22］研究发现神经元树突的Mitoflashes 在短程记忆向长时记忆的转化中可能发挥着关键作用，揭示了Mitoflashes 作为数字化的生物信号在线粒体接收、整合、传递信号中的重要作用。

1.4 ROS 的清除机制细胞和线粒体内多种抗氧化酶和抗氧化物如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽还原酶、胱甘肽和过氧化物氧化还原酶等均可以清除ROS，调节线粒体ROS 的生成，从而维持正常生理条件下细胞内ROS的平衡［23］。ROS 稳态的破坏，是机体产生疾病和加速老化的重要因素，ROS 清除剂则可以减轻这种损伤，近年来以线粒体和ROS 为靶点治疗机体功能异常的研究也较为广泛［24-26］。

2 ROS与线粒体介导的细胞凋亡

线粒体不仅是细胞内ROS 的主要来源，也是细胞凋亡的调控中心。线粒体膜受到ROS 的攻击后，发生脂质过氧化、膜通透性改变、mPTP 开放、细胞色素c（Cytochrome c，Cyt c）释放等变化，激活细胞内线粒体凋亡途径，介导细胞凋亡。

2.1 ROS激活Bcl-2蛋白家族诱导细胞凋亡过量的ROS 激活线粒体内凋亡相关蛋白，是ROS 参与线粒体介导的细胞凋亡的重要机制。Bcl-2 蛋白家族是调节线粒体相关凋亡因子释放的主要因子。Bcl-2 家族成员根据其结构和功能的不同分为3 类，即Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w 等抗凋亡蛋白，Bim、Bid、DP5 等BH3-only 蛋白和Bax、Bak 促凋亡蛋白。其中Bak 以及Bcl-2，Bcl-xL 等主要位于线粒体外膜。当ROS 攻击线粒体膜后，Bcl-2，Bcl-xL 可被蛋白激酶磷酸化或经caspase 催化裂解，转变为促凋亡蛋白，而Bax接收到ROS 刺激下的凋亡信号后，在线粒体膜上形成凋亡小体，促进Cyt c 释放，激活caspase 介导的级联放大反应，从而诱导线粒体途径的细胞凋亡［27-28］。

2.2 ROS 改变线粒体膜通透性促进细胞凋亡线粒体膜的通透性主要靠mPTP 的开放与关闭来调节。mPTP 的开放使线粒体膜间隙存在的大量小分子蛋白物质释放，诱导Caspase 依赖和非依赖途径的细胞凋亡，其中ROS 也参与了调节的过程。mPTP 短暂可逆开放，ROS 的释放和聚集构成了一种适应性内控功能。而较长时间的mPTP 开放可能释放过量ROS，导致线粒体破坏，从而引起细胞损伤和死亡。当ROS 不能被及时清除而聚集时，会导致膜受体失活、mPTP 开放、膜通透性增加、膜电位下降、caspases 活化、凋亡诱导因子释放，使线粒体功能发生障碍。过量的ROS 和持续开放的mPTP相互耦联，形成恶性循环，最终导致细胞凋亡［13］。

2.3 ROS损伤线粒体DNA 引发细胞凋亡线粒体是真核细胞中唯一具有独立于细胞核DNA 的细胞器，由于线粒体基因组不受组蛋白的保护，线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）的突变率是核DNA的10～20倍，尤其是大脑、肌肉和心脏等耗能较多的器官会受较大影响［29］。mtDNA 是约16.6 kb 的环状分子，编码线粒体呼吸链的RNA 和多肽。ROS增多能引起mtDNA 单链的断裂和无碱基位点的形成，对mtDNA 造成不可逆的氧化损伤，而mtDNA 的损伤降低了线粒体呼吸链的功能，使ROS 生成增加，由此出现的ROS-mtDNA损伤的恶性循环最终引发细胞凋亡［30］。

3 ROS介导的线粒体损伤在ALS中的研究

ALS的主要特征是脊髓前角和大脑的运动神经元退化，导致进行性肌无力、肌肉萎缩和呼吸衰竭等。运动神经元退化的致病机制非常复杂，包括RNA 毒性、兴奋性毒性、蛋白质稳定的破坏、轴突转运的缺陷、氧化应激和线粒体功能障碍等［31］。其中，ROS 的变化及其引起的线粒体损伤和凋亡程序的启动是ALS 致病的重要因素之一［32］，最终引起运动神经元功能障碍，引发神经退行性的病理变化。

3.1 ALS 中存在线粒体结构损伤脊髓和肌肉解剖/活检标本的超微结构研究显示，ALS 患者的线粒体形态存在明显缺陷。Sasaki 等［33］对ALS 患者腰椎（L1-L5）的研究发现，脊髓前角神经元中存在聚集的黑色线粒体。这些神经元的体细胞中线粒体出现肿胀，并伴有明显增加的嵴，或多层嵴甚至堆叠成丝状结构。在ALS 的体内模型中，线粒体的结构损伤和网络的断裂通常发生在发病早期，这表明线粒体形态学改变可能是神经退化的直接原因，而不是后果［34-36］。

3.2 ALS中抗氧化系统失衡研究发现在SOD1基因突变的ALS 患者的成纤维细胞内，出现SOD1 蛋白在细胞质异常聚集、线粒体功能异常及ROS 水平改变，结果提示内源过量的ROS 可能对线粒体产生毒性作用，揭示了抗氧化系统的重要意义［37］。唐迪等［38］对62例ALS患者血清中SOD和GSH-Px的含量进行检测，结果显示病程较长组患者血清SOD、GSH-Px水平低于病程较短组患者，重度病情组患者这两项指标低于轻中度病情组患者，表明ALS 患者体内可能存在抗氧化系统失衡，由此导致大量ROS聚积对神经元造成氧化损伤。SOD 和GSH-Px 可作为ALS 患者疗效评价、估计病情及判断预后的动态参考指标。

3.3 ALS 中线粒体呼吸链功能异常多项研究表明，在ALS 患者的骨骼肌和脊髓中，都能检测到线粒体呼吸链复合物I、II、III 和IV 的活性降低［39-42］。Barber 等［43］在发病前的SOD1G93A转基因小鼠中，发现ATP 合成受损以及大脑和脊髓中线粒体呼吸速率降低，并且该现象一直贯穿疾病的整个过程。上述研究表明ALS 进程中存在线粒体呼吸链功能异常、氧化磷酸化功能障碍、产生ATP 减少等现象，从而导致运动神经元的死亡和加剧骨骼肌的萎缩。

3.4 ALS 中ROS 损 伤mtDNA 的 研 究过 量 的ROS 能导致mtDNA 单链断裂，破坏其结构和功能，影响下游的转录和翻译过程；也可诱发mtDNA 突变，导致其发生氧化修饰，形成具有致核酸突变作用的碱基氧化产物，引起ATP 生成障碍和ROS 水平升高，而高水平的ROS 会进一步引发核酸突变［44］。研究发现两种新基因NEK1 和C2lorf2 的突变与ALS发病有关［45］。其中，NEK1杂合子突变与散发性ALS有关，NEK1能与已知的两种ALS相关蛋白（ALS2和VAPB）相互作用，这种相互作用为NEK1 参与ALS的发病机制提供了功能证据［46-47］。另外两项独立的病例对照研究证明了NEK1 与ALS 相关，并指出它可能占所有ALS 病例的2%左右［48-49］。在全基因组关联分析研究中发现，C21orf2的突变与ALS风险增加有关［50］。NEK1 和C21orf2 相互作用，参与DNA 损伤和修复以及影响线粒体功能，但其影响ALS 的具体机制还需更完善的研究［51-52］。

3.5 失控的mPTP 开放与ALS 进程相关失控的mPTP 开放是促进线粒体生成ROS 的关键因素。有研究表明，环亲素D（Cyclophilin D，CypD）能促进mPTP 的开放［53］。Xiao 等［54］检测了发病前后G93A小鼠骨骼肌线粒体中CypD 的表达，与WT 小鼠相比，2 月龄G93A 小鼠（发病前）骨骼肌线粒体中CypD 的相对水平没有变化，而4 月龄小鼠（发病后）骨骼肌线粒体中CypD 水平显著增加。该研究提示线粒体中CypD 的表达水平与疾病分期呈相关的关系，CypD 可能通过调节mPTP 的开放影响ROS 生成，从而在ALS的进展过程中发挥重要作用。

4 结语与展望

ROS 的产生主要有3 种模式：线粒体呼吸链复合物生成、ROS 诱导的ROS 释放即RIRR 机制和Mitoflashes 模式。而ROS 的清除由细胞内的抗氧化系统包括多种抗氧化酶类和抗氧化物共同完成，ROS的产生与清除机制共同调节机体内ROS 的浓度。正常水平的ROS 在调节各项生命活动中发挥重要作用，ROS 异常增多或抗氧化系统失衡，会造成线粒体损伤并导致疾病的发生发展。由此可见ROS与线粒体之间的关系非常密切，互为因果。ALS 是一种复杂的多因素疾病，目前尚无有效的治疗措施。大量研究表明，在ALS 疾病进程中过量的ROS会影响线粒体代谢功能，导致线粒体内抗氧化系统失衡，干扰mtDNA 的转录与翻译，改变线粒体膜的通透性和降低膜电位，使mPTP 不可逆开放从而产生更多的ROS，诱导线粒体介导的细胞凋亡，最终引起神经元的退化和肌肉的萎缩，加剧ALS 的进程。综上所述，在ALS 进程中ROS 的水平及其介导的线粒体损伤是非常重要的致病因素，深入研究ALS 进程中的ROS 变化以及线粒体功能与ROS 之间的关系，可能为ALS 的预防和治疗提供新的实验依据和策略。