异种生物材料应用于角膜移植的研究进展

靳 荷，钟兴武

(1.桂林医学院附属医院眼科,广西 桂林 541002； 2.中山大学中山眼科中心角膜科，广州510060)

角膜病是常见的致盲性眼病，仅次于世界第一致盲性眼病白内障[1]。每年均有150万～200万新增角膜盲病例[2]。目前，仍有总数超1 000万例的双眼角膜盲患者[2]。而角膜移植一直是很多角膜病变的最有效解决方法。同种异体的角膜移植手术在治疗角膜盲上取得了一定进展[3]。但近年来通过捐献并能应用于临床的角膜材料越来越紧张，很难满足患者的需求。每年全世界仅能实施10 000台角膜移植手术，而其中一部分移植手术后患者会因移植排斥反应和复杂炎症反应而导致移植失败[4]。

目前，各种人工生物材料和脱细胞生物材料的研发有助于在一定程度上缓解人类供体角膜的紧张情况。多项关于这些替代角膜材料的研究相继被报道[5-7]。目前，大量关于猪眼角膜的移植实验研究在一定程度上取得了很多研究成果[8-10]。现就异种材料在角膜组织中的应用进展及价值进行综述。

1 角膜概述

1.1角膜的解剖结构及免疫特性 角膜组织在结构分为上皮细胞层、前弹力层、基质层、后弹力层和内皮细胞层，角膜基质内的胶原结构排列整齐，与角膜表面平行，平行排列的胶原结构能对进入眼的光线进行折射，减少散射。同时，角膜内皮细胞有“泵”的作用，通过Na+，K+-ATP酶活性维持房水和角膜Na+的梯度浓度，使角膜呈相对脱水状态，是维持透明性的主要因素。同时，角膜组织没有血管、淋巴等组织，使其在免疫反应中享有免疫豁免特权，相对于肝、肾、心脏等器官的移植，发生组织排斥的概率大幅度降低[11-12]，是其能够实现异种移植的免疫基础。供体植片经过处理后，能在解剖上和功能上实现成功是异种移植成功的主要原因，其中解剖和功能上的因素包括组织构建、角膜生物力学稳定性、细胞行为学、屈光力等，同时，这些因素也应与人类供体的相一致。目前，猪眼角膜被认为是一种具备替代人供体的生物替代材料之一。

1.2异种角膜移植材料的相关处理方式 近年来，各国研究者正在努力研究探寻一种安全、高效的移植材料来缓解角膜供体的紧张情况，同时也能降低手术移植排斥反应发生率。早在1987年McCarey等[13]研究采用氧化铅玻璃植入手动机械刀切开的角膜基质层中，矫正无晶体眼所致的高度远视，但出现了角膜植片坏死及植片排出等严重并发症。之后有研究者将聚甲基丙烯酸甲酯材料、水凝胶材料等人工合成材料植入角膜基质中进行观察，但均有中毒性角膜基质炎、植片排出、植片溶解等并发症的报道[14-15]。人工合成材料的植片应用于角膜移植还有待改进，所以应用异种的脱细胞生物材料作为供体植片进行角膜移植开始受到关注。研究表明，脱细胞处理后的角膜材料可作为角膜组织再生的支架[16]。但有效通过化学或物理方法去除移植组织中的细胞成分，同时仍能保持组织的固有结构是目前的一大难题[17]。目前有很多脱细胞方法，包括冻干法、射线法、化学法、物理法等[18]。冻干法是常用方法[19]，此方法减少了物理及化学损伤，也减少了角膜组织蛋白变性[20]，但对移植后受体角膜基质细胞的迁移生长存在一定影响，术后的屈光矫正度数也存在一定问题[18]。应用化学法和物理法对角膜材料进行脱细胞处理后可能会因柔韧性变差而导致植片不能进行移植[21]。同时，此种脱细胞处理也可能会改变角膜基质的微环境，从而导致移植失败[22]。

对于通过射线照射脱细胞方法，研究证实γ射线照射后可以显著降低角膜的免疫原性，疾病传播风险和植片被感染率[23]。虽然X线和γ射线的能量和发生机制不同，但两者都是电磁波，均具备一定的组织穿透能力，在一定程度下均能引起组织内的细胞发生凋亡，所以生物学效应相同[24]。因为γ射线源于放射性元素的衰变，γ射线对组织的破坏性更强，在空气中传播几乎不受影响[25]，所以γ放射源的管理非常严格。而X线广泛应用于放疗，使用更加安全、可控，来源也更方便。目前眼部X线的研究大多在于活体眼部肿瘤治疗和对眼部正常组织保护性的研究[26]。因此，利用X线进行离体角膜脱细胞处理是一个全新的研究领域。

角膜基质主要由含细胞量相对较少的细胞外基质构成。平行的胶原纤维(主要是Ⅰ、Ⅴ型胶原纤维，后者约占20%)组成了250～400个胶原小薄板，而两个邻近的胶原小薄板的胶原纤维几乎垂直[27]。正常的角膜结构和完整胶原排列组织是保持角膜透明性的必要条件[28]。当角膜结构不可逆的改变时，角膜的透明性也不会恢复[29-30]。目前很多研究在将异种植片处理后角膜的透明性均下降，然而X线或γ射线照射后发现角膜透明性无明显改变，虽然在Masson染色中只能发现透镜仍保持胶原结构，但用电镜观察透镜中超微结构发现了胶原结构的改变。虽然透镜的胶原结构发生了变化，变得稀疏，但并没有影响透镜的透明度，这也与Chae等[31]的研究结果相符，由于角膜基质中小直径的胶原纤维增加，增加了纤维间距从而保持角膜的透明性。Stevenson等[23]和Gotoh等[32]研究发现，高剂量的射线可以减少胰岛细胞的移植免疫排斥反应，而γ射线照射能减少角膜植片的变异源。X线和γ射线均对组织具有一定的穿透力，均能诱导组织中细胞凋亡。γ射线由于强大的放射能，对放射源管理非常严格。而X线波长较γ射线更长，X射线更加安全、可控，来源及临床应用更广泛。

1.3猪来源的异种角膜移植材料的限制因素 将异种脱细胞生物材料作为供体应用于角膜移植面临的主要难题是人类供体与异种供体角膜厚度的统一，这就导致手术中很难进行边缘的对齐与缝合，嫁接组织结构厚度的不统一将导致移植失败。人类角膜的中央厚度平均为536 μm[33]，而猪眼角膜的中央厚度达到了659～995 μm，且不同年龄段猪眼角膜厚度差距也较大[34]。猪眼角膜在经过脱细胞处理和保存后水肿程度大大增加，对于中央角膜厚度的测量也存在很大误差。Choi等[8]将脱细胞处理后的猪眼角膜移植到非人类灵长类动物(恒河猴)中，移植后植片中央角膜厚度减少了400 μm。因此他们指出，保存后的猪眼角膜厚度若在850 μm左右，则比较适合进行异种移植，能够应用于人类受体的异种移植研究，但目前对于超过950 μm的猪眼角膜还正在进行相关的异种移植研究。

另一个异种角膜移植手术限制因素为角膜的生物力学。研究表明，猪眼角膜生物力学与人类非常接近，但柔韧性和黏性较人类低[35]。然而在非人类的灵长类动物实验中，这样的生物力学差距并没有影响异种植片的存活率和长期的生物力学稳定性。猪眼角膜的屈光力为40 D，相较于人角膜的44 D可以作为接受异种移植的材料[35-36]。同时，猪眼角膜屈光力可以通过移植时调整植片大小与曲面弧度来增大屈光力，以达到接近人类供体的水平。

再者，角膜植片的透明性是视功能的重要需求，所以内皮细胞的密度和功能必须与人类供体的相似。虽然猪眼角膜的内皮细胞功能与人类的相似，具有“泵”的作用，使角膜呈相对脱水状态，维持角膜的透明性，但猪眼角膜内皮细胞密度会随年龄的增长而降低，也存在同种异体的差异，所以在选择植片供体前应考虑猪的不同品种和年龄的差异[37]。

2 异种角膜移植的免疫学

具有良好的组织相容性的角膜供体植片是移植成功的基础。虽然角膜是无血管、无淋巴管的组织，但在接触到猪来源的抗原后仍会同时发生体液免疫和细胞免疫，从而诱导对异种来源的植片发生排斥反应[38]。在猪眼角膜中，抗原的分布情况已被很多研究证实，在上皮细胞层、基质层和内皮细胞层中均有不同的高浓度抗原存在[39-40]。灵长动物的血清能够结合这些异种的抗原，产生抗原抗体反应，引起排斥，特别是在上皮细胞层和富含胶原组织的基质层这类反应更加明显。但目前研究表明，在内皮细胞层没有或仅有一小部分异种抗原能引起免疫反应[40]。脱细胞技术的应用使异种供体的抗原大幅度降低，从而降低了在活体动物实验中这种异种抗原带来的严重免疫抗原抗体反应[41]。目前，研究证实降低猪眼角膜中Gal和NeuGc两种抗原的表达可以显著降低人受体的抗原抗体反应[42]。但完全抑制这两种抗原的表达是否可以提高猪眼角膜植片的存活率仍是一个值得探讨的问题。

在体外研究中，体液免疫和细胞免疫均能引起α1,3 -半乳糖基转移酶基因敲除来源的猪眼角膜中内皮细胞的免疫反应，与野生型来源的猪眼角膜相比，加入人来源的CD46因子可以显著降低α1,3-半乳糖基转移酶基因敲除来源的猪眼角膜中的免疫反应[42]。体外研究表明，来源于基因调控的猪眼角膜能够减少T细胞对人受体的免疫反应[6]。这些研究说明，来源于α1,3-半乳糖基转移酶基因敲除/CD46的猪眼角膜可以在一定程度上减少灵长类动物异种移植的排斥免疫反应。野生型来源的猪眼角膜能够诱导体液免疫和细胞免疫，特别是针对一些高风险移植的手术患者(炎症期或者新生血管增殖期)，这两种免疫反应会更加强烈。因此，转基因来源的猪眼角膜可能成为异种来源的角膜植片应用于临床。在动物实验中，非人类灵长类动物的异种角膜移植研究表明，各种猪来源的异种角膜植片并不会引起强烈的免疫反应，同时，体液免疫反应和细胞免疫反应均在异种植片排斥时发生[6,8,10]。

3 非人类灵长类动物异种角膜移植的动物模型的研究

Kim等[6]和Choi等[8]依照供体猪的种类、受体的种属、免疫抑制和角膜移植技术多方面进行供体角膜生存率总体评估，研究发现经过处理的异种角膜供体(如脱细胞移植或脱水处理的植片)较新鲜的异种植片存活率更高。在应用类固醇激素治疗中，使用异种角膜植片，前板层角膜移植较穿透性角膜移植术植片存活率更高。目前，无论使用基因工程猪还是实验种属猪来源的异种植片，在分别进行前板层异种角膜移植术后，异种植片的存活时间均没有超过120 d。然而，选用野生型来源的猪眼角膜进行穿透性角膜移植，同时给予足够的CD154抗体，可以达到超过6个月的植片存活率。总之，用新鲜的异种植片进行角膜异种移植仍需要使用大量的免疫抑制和类固醇激素[42]。

除解决异种移植的植片应用外，实现异种移植还有一个主要的障碍——手术方式的选择。在钟兴武教授课题组的研究中，用小切口全飞秒激光辅助进行异种植片的移植，将兔和人的新鲜植片进行甘油冻存2周后，利用小切口全飞秒激光的辅助作用，做2 mm切口，将植片植入猴眼角膜的角膜层间[43]。在为期2年的观察中，猴眼角膜植片保持透明，无植片溶解、植片脱出等现象发生[43]。这种手术方式利用飞秒激光辅助，可以在层间形成规则、可控、切削平面高度一致的层间切口，大幅度提高了手术效率。更重要的是，此种层间板层角膜移植手术方式使供体植片隔绝了角膜上皮泪液因子和内皮细胞的影响，在一定程度上减少了受体组织因手术的炎症反应对植片的刺激，增大了植片的存活率。同时，植片的层间植入改变了受体角膜的体积和曲率，将角膜重新塑形，因为植片的屈光度数是可控的，所以这种增加性的屈光移植手术，不仅改变了角膜的体积还能改变整个眼前段的屈光状态。该手术方式在单纯移植方面，可以应用于角膜溶解、角膜扩张、圆锥角膜等基质层加固性手术，在屈光方面，可以应用于远视、老视等研究。所以，小切口全飞秒激光辅助进行异种植片的移植这种手术方式是高效、预测性强、具有应用前景的手术方式。

4 展 望

近年来，很多关于脱细胞猪眼角膜的应用研究被相继报道，其中，有进行手术方式改进后并成功降低异种植片免疫排斥反应的报道，也有在猪眼角膜脱细胞处理方式上改进后移植于人眼并移植成功的病例报道。在这些前驱研究的基础上，关于猪眼角膜免疫工程学的研究及其相关法律、法规、伦理相继进行专家研讨后，猪眼角膜在不远的将来可以在多方面应用于临床，也将大幅度缓解临床供体紧张的现状，造福于更多角膜病患者，降低角膜盲的发病率。