骨髓细胞形态学和流式细胞术在非霍奇金淋巴瘤患者骨髓侵犯诊断中的价值比较

张巧梅，席大力，康 成，李燕平

(兰州大学第一医院 a.血液科，b.病理科，c.检验科，兰州 730000)

非霍奇金淋巴瘤 (non-Hodgkin′s lymphoma，NHL)是一种常见的血液系统恶性肿瘤，是淋巴细胞分化过程中的克隆性增生，90%的NHL是成熟B细胞淋巴瘤，患者发病的中位年龄为50岁[1]。诊断时通过骨髓活组织检查评估NHL骨髓侵犯的发生率为30%～50%，不同病理类型NHL骨髓侵犯的发生率差异较大，其中B-NHL骨髓侵犯的发生率高于T-NHL[2-3]。而NHL患者骨髓是否受到侵犯是NHL分期的重要组成部分，故及早发现NHL侵犯骨髓对NHL患者的分期、疗效及预后评估具有重要的临床价值。由于淋巴瘤细胞侵犯骨髓的复杂性及淋巴瘤细胞形态的多样性，骨髓活组织检查为主要的诊断方法，目前其为诊断淋巴瘤侵犯骨髓的金标准，但还需要辅助其他检查(流式细胞术、分子生物学技术)进行精确诊断[4]。流式细胞术免疫检测是对群体细胞中每个细胞是否表达特定抗原进行分型，是必不可少的诊断步骤。流式细胞术分析骨髓是否受到淋巴瘤细胞的侵犯主要通过轻链限制性检测和抗原错译表达来判断。本研究主要分析骨髓细胞形态学和流式细胞术检测在NHL患者骨髓侵犯诊断中的价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取 2015年6月 至2018年11月兰州大学第一医院收治的NHL疑似骨髓侵犯患者150例。其中，男93例、女57例；年龄3～92岁，中位年龄58岁。B细胞淋巴瘤127例，T细胞淋巴瘤23例。以骨髓活组织检查为NHL骨髓侵犯诊断的金标准。所有患者的淋巴瘤病理诊断参照世界卫生组织2008年造血和淋巴组织肿瘤分类标准[5]。临床分期参照Ann-Arbor分期[6]： Ⅰ 期7例， Ⅱ 期30例，Ⅲ期35例，Ⅳ期78例。其中，57例患者有不明原因的反复发热(经常体温38 ℃以上)、盗汗及无其他原因体重减轻。

1.2方法 用2%利多卡因2～4 mL局部麻醉后于患者髂(前)后上棘穿刺。先行骨髓穿刺术，抽吸0.2 mL骨髓液涂片6张，更换10 mL无菌注射器，抽取骨髓液1 mL经乙二胺四乙酸二钾抗凝，进行流式细胞术检查。

1.2.1骨髓细胞形态学检查 选择制作良好的骨髓涂片，进行瑞氏-姬姆萨染色，然后用油镜(×1 000)在体尾交界处进行有核细胞形态学观察并分类计数200个有核细胞。淋巴瘤细胞骨髓侵犯的诊断参考文献[7]：骨髓涂片有核细胞分类中淋巴瘤细胞≥5%者诊断为NHL骨髓侵犯；骨髓涂片有核细胞分类中淋巴瘤细胞≥20%者诊断为淋巴瘤细胞白血病。

1.2.2流式细胞术检查 采取乙二胺四乙酸二钾抗凝骨髓标本，由同一检验师对6色流式细胞仪进行质量控制及标准操作。用直接免疫标记法进行免疫分型检测。仪器为美国BD公司生产的双激光管FACS-CantoⅡ型流式细胞仪，使用分析软件DIVA分析10 000个细胞抗原的表达情况。采用CD45/侧向角散射设门圈定异常细胞群，并通过CD3和CD20的表达情况来区别瘤细胞来源于T细胞系或B 细胞系，其中B淋巴细胞淋巴瘤根据瘤细胞是否表达CD5、CD10分为4组：CD5+、CD10-常见于慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞淋巴瘤及边缘带淋巴瘤等；CD5-、CD10+常见于滤泡性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫大B细胞淋巴瘤等；CD5+、CD10+常见于滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤等；CD5-、CD10-常见于边缘带淋巴瘤、毛细胞白血病等,再进一步根据CD23、CD43、CD123、CD103、CD79鉴别上述疾病。T细胞淋巴瘤常见于CD3、CD5强度改变，自然杀伤细胞肿瘤常见CD2、CD7、CD56、CD8、CD16的改变，血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤常用CD7、CD3表达下降；外周T细胞淋巴瘤通常有CD5、CD7缺失[8]。两种方法中任一方法阳性即为联合诊断阳性。

1.3统计学方法 采用SPSS 21.0统计学软件进行数据处理，计数资料用百分比表示，诊断价值采用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，ROC曲线)评价，ROC曲线下面积越大诊断价值越大，ROC曲线下面积为0.5～0.7表示诊断价值较低，0.7～0.9表示诊断价值中等，0.9以上表示诊断价值较高。

2 结 果

2.1骨髓活组织检查结果 经骨髓活组织检查最终确诊骨髓侵犯患者54例，未侵犯患者96例。不同病理类型NHL骨髓侵犯结果：弥漫大B细胞淋巴瘤71例，其中骨髓侵犯15例；滤泡细胞性淋巴瘤13例，其中骨髓侵犯5例；慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤13例，其中骨髓侵犯11例；间变大细胞型淋巴瘤8例，其中骨髓侵犯2例；套细胞淋巴瘤8例，其中骨髓侵犯3例；淋巴浆细胞淋巴瘤 7例，其中骨髓侵犯5例；自然杀伤细胞/T细胞淋巴瘤7例，其中骨髓侵犯1例；黏膜相关淋巴组织结外边缘区B细胞淋巴瘤6例，其中骨髓侵犯1例；边缘型淋巴瘤4例，其中骨髓侵犯3例；外周T细胞淋巴瘤4例，其中骨髓侵犯2例；T母细胞淋巴瘤3例，伴骨髓侵犯；B母细胞淋巴瘤2例，伴骨髓侵犯；伯基特淋巴瘤1例，伴骨髓侵犯；介于伯基特/弥漫大B细胞淋巴瘤不能分类的淋巴瘤、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、纵隔大B细胞淋巴瘤各1例，这 3例中未见骨髓侵犯。

2.2骨髓细胞形态学、流式细胞术和两种方法联合诊断NHL骨髓侵犯的结果 骨髓细胞形态学和流式细胞术联合检测的阳性率为30.67%(46/150)，高于单独骨髓细胞形态学[22.67%(34/150)]、流式细胞术[27.33%(41/150)]。骨髓细胞形态学诊断NHL骨髓侵犯的灵敏度、特异度、约登指数、正确率、阳性预测值、阴性预测值和阳性似然比均低于流式细胞术，阴性似然比高于流式细胞术；联合检测的灵敏度、约登指数和阴性预测值均高于两种方法单独检测，特异度、阳性预测值、阳性似然比和阴性似然均低于两种方法单独检测。见表1和表2。

表1 骨髓细胞形态学、流式细胞术和联合诊断NHL骨髓侵犯的结果 (例)

表2 骨髓细胞形态学、流式细胞术和联合检测的诊断效能

2.3骨髓细胞形态学、流式细胞术和两种方法联合评价NHL骨髓侵犯的ROC曲线分析 NHL骨髓侵犯以骨髓病理检查即骨髓活组织检查为金标准，绘制骨髓细胞形态学、流式细胞术和两种方法联合检测的ROC曲线，见图1。骨髓细胞形态学的ROC曲线下面积为0.763，流式细胞术为0.843，两种方法联合检测为0.853，骨髓细胞形态学、流式细胞术和两种方法联合检测的诊断价值中等，且两种方法联合检测的ROC曲线下面积大于单独检测。见表3。

ROC：受试者工作特征

表3 骨髓细胞形态学、流式细胞术和两种方法联合检测的ROC曲线下面积及相关参数评价

ROC:受试者工作特征

3 讨 论

NHL是原发于淋巴组织的恶性肿瘤，具有很高的侵袭性，可以扩散至全身各组织。由于淋巴组织与血液系统密切相关，所以骨髓也容易受淋巴瘤细胞侵犯，表现出不同的症状和体征，骨髓浸润和(或)其他组织侵犯的患者处于Ⅳ期，提示预后不良[9]。Sheikhpour等[10]报道，西方国家T细胞淋巴瘤约占所有NHL的12.98%。而Ko等[11]报道，亚洲的T细胞NHL发病率高于西方国家，本研究结果与该结果一致。NHL侵犯骨髓早期缺乏特异性临床特征，而NHL是否侵犯骨髓作为淋巴瘤分期的一部分，对早发现、早诊断和早治疗淋巴瘤骨髓侵犯患者具有重要的临床价值。目前，骨髓活组织检查及免疫组织化学染色评估仍是检测淋巴瘤骨髓侵犯的标准方法。近年来，流式细胞术分析已成为淋巴瘤骨髓侵犯检测的常规方法。虽然流式细胞术提供了高灵敏度及更具客观性的结果，但其无法代替骨髓病理学检查[12]。不同病理类型的淋巴瘤浸润模式常有所不同。Sovani等[13]对511例淋巴瘤骨髓侵犯患者的浸润模式进行回顾性分析，将淋巴瘤细胞浸润骨髓模式分为弥散型、小梁旁型、间质型、结节型和窦内型。当骨髓穿刺涂片有少量淋巴瘤细胞或骨髓标本被外周血稀释时，很难确认NHL骨髓侵犯，然而骨髓活组织检查能较全面地了解骨髓组织的完整结构，所以确诊淋巴瘤骨髓侵犯时骨髓活组织检查的阳性率明显高于骨髓涂片[14-15]。骨髓细胞形态学检查操作简单，取材方便，形态清晰，且淋巴瘤细胞均有各自的细胞形态学特征，当骨髓涂片中找到5%以上形态异常的淋巴细胞时，可怀疑为淋巴瘤细胞骨髓侵犯，应进一步行骨髓活组织检查及免疫组织化学染色以确定骨髓是否受到淋巴瘤细胞的侵犯[16]。流式细胞术主要通过轻链限制性检测和抗原错译表达判断异常细胞克隆，其根据免疫表型的特征对淋巴瘤进行分型，且在淋巴瘤诊断及鉴别诊断中具有重要价值。

本研究中，NHL不同病理类型淋巴瘤骨髓侵犯的发生率与陈青等[17]的研究结果基本一致；骨髓细胞形态学和流式细胞术的阳性检出率分别为22.67%和27.33%，两种方法联合检测的阳性检出率为30.67%，这与齐贞光[18]的报道基本一致。本研究中，8例NHL患者骨髓涂片中可见可疑淋巴瘤细胞<5%，其中4例骨髓活组织检查及流式细胞术均为阴性，再次换部位穿刺骨髓活组织检查为阳性，4例中2例确诊为弥漫大B细胞淋巴瘤骨髓侵犯，1例为伯基特淋巴瘤骨髓侵犯,1例为外周T细胞淋巴瘤骨髓侵犯；另外4例中，2例第3次骨髓活组织检查为阳性，2例为阴性，表明多次换部位穿刺进行骨髓活组织检查可提高NHL骨髓侵犯的阳性检出率。13例NHL患者经流式细胞术检测未发现淋巴瘤细胞，而经骨髓活组织检测发现患者骨髓受到侵犯，流式细胞术出现假阴性的原因可能有：①T细胞淋巴瘤中少量的淋巴瘤细胞易与反应性T细胞混合，不容易被检出[19]；②一些大细胞容易被实验前处理破坏，如弥漫大B细胞淋巴瘤细胞[20]。骨髓细胞形态学检测淋巴瘤细胞阴性的20例骨髓标本经骨髓活组织检查发现17例NHL患者骨髓受到淋巴瘤细胞的侵犯，而经流式细胞术检测发现8例NHL患者骨髓受到淋巴瘤细胞的侵犯，骨髓细胞形态学检测出现假阴性的原因主要集中在形态学表现为轻度异常的淋巴瘤细胞，如滤泡细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤，此时应用流式细胞术和骨髓活组织检查联合检测可以帮助确定淋巴细胞是否为克隆性改变。研究表明，18F-氟代脱氧葡萄糖正电子发射计算机断层显像/CT具有最佳的阴性预测值，其可用于检测小儿淋巴瘤的骨髓浸润，以减少患儿侵入性检查[21]。

本研究结果显示，骨髓细胞形态学诊断NHL骨髓侵犯的灵敏度、特异度均低于流式细胞术，表明骨髓细胞形态学在诊断NHL侵犯骨髓方面存在很大局限性，尤其对骨髓中瘤细胞比例较低及形态轻度改变的类型，容易漏诊。另外，淋巴细胞反应性增生比例较高时容易误诊为淋巴瘤骨髓侵犯；而流式细胞术可以对骨髓细胞形态学漏诊和误诊的局限性做出补充，两种方法联合检测的灵敏度明显高于单独检测，但两种方法联合检测的特异度低于单独检测，ROC曲线下面积显著高于单独检测，表明两种方法联合检测优于单独检测。目前，骨髓活组织检查、骨髓细胞形态学和流式细胞术检测NHL侵犯骨髓均为侵入性检查，且骨髓活组织检查和流式细胞术检查费用相对较昂贵，对于淋巴瘤细胞高度异型性的NHL类型患者可选择简单快捷的骨髓细胞形态学方法；对轻度异型性的NHL类型患者，形态学不易识别且可疑的患者可进一步进行流式细胞术和骨髓活组织检查。

骨髓细胞形态检查是评价NHL分期的一种简单有效的方法，虽然其不能代替骨髓活组织检查，但对于高度异形的淋巴瘤细胞很容易识别，可做出提示性的诊断。而流式细胞术通过细胞分化抗原的检测对骨髓病理形态学不确定的结果进行补充，可客观准确地判断出异常细胞的表型特征，两者互相补充，联合影像学检查(18F-氟代脱氧葡萄糖正电子发射计算机断层显像/CT)可提高NHL骨髓侵犯的阳性检出率，避免造成漏诊及误诊。NHL侵犯骨髓的模式较多，其早期发现对NHL的治疗方案及预后具有重要意义，未来需进一步研究敏感性和特异性更高的诊断技术。