环状RNA的研究进展及其在胃癌中的临床意义

吴假假综述，许利剑审校

0 引 言

胃癌在全球恶性肿瘤发病率中位列第四，在世界癌症死亡人数中排名第三［1］。尽管近来手术技术的改善及联合化疗的治疗策略［2］，然而肿瘤分子多样性造成的高临床异质性，甚至具有相似的临床特点及病理特征［3］，胃癌5年总体生存率依然很低；由此看出，早期诊断、早期治疗，寻找有效的生物标志物就至关重要，近年关于circRNA在胃癌中的异常表达涌现一些研究，可能会对胃癌诊断及治疗有意义，本文就此进行综述，为胃癌患者的早期诊断、临床治疗及预后判断提供新的理论依据。

1 circRNA的概述

1.1 概念环状RNA（circRNA）是一类闭合的环状结构，无3′端polyA结构及5′端帽状结构，长度在几百到几千不等，不受RNA外切酶降解，稳定且广泛地存在于生物界，具有进化保守性［4］。circRNA在20世纪70年代即被发现，1979年，Hsu和Coca-Pra⁃dos报道利用电子显微镜在真核生物细胞质中发现了circRNA［5］，同时也开启了该类RNA 的研究历程。

1.2 circRNA的初步认识由于科学技术水平的限制，之前一直以为circRNA是基因错误转录及mRNA 加工的副产品［6］；在 2013 年，Jeck 等［7］在《RNA》发文提出circRNA发生的两种模型：套索驱动环化；内含子配对驱动环化，表明circRNA不是简单的错误剪接。另外研究表明circRNA可存在于细胞质、细胞核、血清外泌体以及唾液当中［8］。随后人们陆续在酵母线粒体、丁型肝炎病毒中发现cir⁃cRNA，也发现在小鼠的睾丸内含有性别决定基因（sex-determining region Y，Sry）转录而来的circRNA，还证实了circRNA也存在于人体细胞［9］，由此看来，circRNA广泛并稳定的存在于真核生物中。

2 circRNA形成及功能

2.1 circRNA形成circRNA根据来源分为：外显子序列形成的circRNA（ecircRNA）［7］、内含子序列形成的circRNA（ciRNA）［10］、内含子和外显子共同形成的circRNA（EIciRNA）［11］。在形成circRNA期间，特异性序列是保守的，并且来自上游和下游区域的序列沿相反方向连接在一起，所有这些都通过反向剪接有助于成熟的circRNA［12］。虽然反向剪接的效率远低于线性RNA，但由于其稳定性和相对较长的半衰期，仍然存在大量的circRNAs。反向剪接机制取决于互补内含子匹配［13］，它在circRNA形成过程发挥重要作用。在该机制中，环形RNA的两侧具有特殊的重复序列，如Alu和其他短序列［14］。CircRNA前体的成环区域两侧的外显子序列因重复序列（如Alu）发生互补配对成环，此后，在U6和U2的作用下，拼接体与成环的RNA前体结合，在蛋白复合物和U5核心的协同作用下，选择性地剪切循环区域中的外显子，同时，外显子连接区序列也被反向切割，形成成熟的circRNA［15］。内含子circRNA形成的机制与外显子circRNA的机制不同。内含子circRNA的形成依赖于5′剪切位点附近的富含GU的序列和靠近分支点的核苷酸C富集序列。两个片段首先结合成环状，然后通过拼接体剪切结合部分中的外显子序列和内含子序列，其余内含子最终被拼接在一起形成成熟的 circRNA［9］。最近，Li等［11］发现另外一种新型的circRNA由外显子和内含子组成，根据其互补序列过表达，然而精确的拼接机制尚未确定。

2.2 circRNA功能研究发现circRNA可能通过以下几种方式发挥其生物学功能：

2.2.1 竞争的内源性RNA或miRNA海绵 研究已经证明，circRNACDR1as或 ciRS-7［4，16］，circ-SRY［16］，circ-ITCH［17］，circ-HIPK3［14］能够起到miRNA海绵的作用。例如，首次观察到一个充当miRNA海绵的circRNA是CDR1as，其具有70多个保守的miRNA-7的结合位点［18］。此外，circ-SRY是一种在小鼠睾丸中特异性表达的circRNA，与miRNA-138具有16个结合位点［16，19］。

2.2.2 与RNA结合蛋白相互作用 除了miRNA海绵的功能外，circRNA还可以与RNA结合蛋白相互作用，如 circFoxo3 和 circ-MBL（muscleblind）［20-21］。CircFoxo3能够与许多类型的蛋白质结合，它可以通过与CDK2和p21相互作用来抑制细胞周期并阻止从G1到S期的转变［21］。另外，研究人员发现，内含子序列形成的circRNA可以在细胞质中积累，并与蛋白TDP43结合，抑制ALS（肌萎缩性侧索硬化）中的TDP43毒性［22］。

2.2.3 调节mRNA稳定性 一些circRNA可以调节mRNA的稳定性。例如，来自CDR1as的环状反义RNA可以与mRNA形成双链体结构，使其稳定［23］。此外，在小鼠巨噬细胞中，circ-RasGEF1B可以增强ICAM-1mRNA的稳定性［24］。

2.2.4 调节基因转录 circRNA也可以调控基因转录。例如，两种外显子-内含子环状RNA如circ-EIF3J和circ-PAIP2都可以与U1 snRNP结合以进一步与RNA Pol II相互作用并增强亲本基因在HeLa和HEK293细胞中的表达［11］，因此外显子和内含子共同组成的circRNA（EIciRNAs）可以在正反馈调节中发挥重要作用。CiRNA也可以调节基因转录。研究人员发现，ci-ankrd52和ci-sirt7也可以通过与Pol II相互作用可以作为其亲本基因转录的正调控因子［10］。这表明内含子circRNA也可以调节亲代基因转录。

2.2.5 翻译蛋白质 内源性circRNA被证明能够被翻译成蛋白质。 Legnini等［25］发现在 IRES（内部核糖体进入位点）驱动下，circ-ZNF609可以翻译小鼠成肌细胞中的蛋白质。在这个令人信服的证据出来之前，大多数研究人员认为circRNA是一类独特的内源性非编码RNA。然而发现能够翻译蛋白质的第一个circRNA是甲型肝炎病毒的基因组，该类病毒是一种单链环状RNA，其可以产生122个氨基酸的蛋白质［26］。一些报告显示，在起始密码子上游具有IRES序列的人工环状RNA可以在体外翻译功能性GFP（绿色荧光蛋白）［27］。其他研究表明，具有多个FLAG编码序列的合成环状RNA也可以在不存在用于内部核糖体进入的任何特定元件的情况下通过类似于滚环扩增的机制翻译蛋白质［28］。该发现使得circRNA具有新的功能，为今后的circRNA研究提供了新的方向。

3 circRNA在胃癌中的异常表达

Li 等［29］报 到 一 种 典 型 的 circRNA：cir⁃cRNA002059，在胃癌组织中，circRNA002059的水平比邻近的正常组织显著下调，还揭示了circRNA的低水平与远处转移之间的相关性，表明circRNA在胃癌组织中异常表达，参与胃癌的发生发展。

3.1 胃癌中上调的circRNA

3.1.1 CircPVT1 Chen等［30］通过qRT-PCR检测胃癌组织和相邻正常组织中circPVT1的表达，结果表明，胃癌组织中的circPVT1表达明显高于对照组相邻正常组织。CircPVT1通过作为海绵抗miR-125家族成员促进胃癌细胞增殖，除了促进胃癌生长，功能研究进一步证实了circPVT1在胃癌中高度表达是胃癌患者生存的独立预后指标.

3.1.2 circRNA0047905、0138960、769015 Lai等［31］通 过 分 析 RT-PCR 实 验 数 据 ，证 实 了 cir⁃cRNA0047905，circRNA0138960和circRNA7690-15在胃癌组织中显着上调，其机制可能为调节亲本基因如SERPINBmRNA、GDAmRNA的表达。他们通过绘制一个接收机工作特性曲线进一步评估了这3种环状RNA的诊断价值。我们发现cir⁃cRNA0047905曲线下面积（AUC）为 0.85（95%CI：0.751-0.950），表明circRNA0047905的诊断准确度最高。circRNA0138960和circRNA7690-15具有较低的诊断准确性，circRNA0138960和circRNA7690-15的 AUC 分别为 0.647（95%CI：0.508-0.786）和0.681（95%CI：0.546-0.815）。

3.2 胃癌中下调的circRNA

3.2.1 circRNA0000745 其由精子抗原与calponin同源性和卷曲螺旋结构域1基因编码形成，位于chr17：20107654-20109225。Huang 等［32］研究发现circRNA0000745在胃癌组织中表达下调，下调机制可能与其可绑定一系列miRNA相关，其表达水平与肿瘤类型有关，circRNA0000745的ROC曲线下面积（AUC）在血浆中为0.683，若结合癌胚抗原，AUC增加至0.775，表明具有良好的诊断价值，但仍未发现与肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期有统计学价值，具体与肿瘤的病理学特点仍需进一步探索。

3.2.2 circRNA100269 CircRNA100269是染色体1的GRCh38.p7的外显子circRNA转录物，Zhang等［33］发现CircRNA100269在胃癌中下调，通过靶向miR-630抑制肿瘤细胞生长，两者在胃癌组织中呈负相关，表明circRNA极有可能成为胃癌早期诊断和预后的稳定的肿瘤标志物。

3.2.3 circRNA LARP4 Zhang等［34］发现 circRNA LARP4在胃癌中抑制细胞增殖与侵袭，机制是通过海绵状miR-424-5p和调节LATS1表达，高miR-424-5p的表达或LATS1低表达与胃癌患者的病理分期，总体生存率呈正相关，miR-424通过靶向LATS1基因促进细胞的生长与侵袭，证明circLARP4起到肿瘤抑制作用，进一步确定了致癌miR-424与LATS1表达呈负相关。这可能在肿瘤诊断、预后和治疗上作为新颖的生物标志物。

3.2.4 circRNA0001649 Li等［35］研究 表 明 ，cir⁃cRNA0001649在胃癌组织及血清中均下调（P值＜0.01），可能与胃癌类型有关，具有相对较高的敏感性及特异性，可能作为筛查胃癌的生物标志物，但具体的分子机制仍需进一步探索。

3.2.5 circRNA104916 通过数据库CircBase发现circ-104916是从染色体区域9q33.3生成的，该区域由NEK6的外显子1、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6和外显子8反向剪接。成熟circ-104916转录物是651nt的环状RNA分子［36］。Li等［37］通过微阵列分析研究发现circRNA104916通过抑制上皮间质转化从而抑制肿瘤细胞，分子表达水平与肿瘤入侵深度、分期、淋巴转移及神经侵袭有关，另外miR-7间接靶向 FAK 上调 E-钙粘蛋白和 IGF1R［38-39］，从而降低上皮至间质转变，减少不依赖贴壁的生长和转移的抑制，总结以上，circRNA104916可能通过靶向miR-7发挥作用，可见，CircRNA可成为一个新的治疗靶点和潜在的胃癌生物标记。

3.3 circRNA与胃癌术后复发已经有报道称cir⁃cPVT1，circ0000190 和 4 个 基 于 circRNA（ cir⁃cRNA101308、circRNA104423、circRNA104916和circRNA100269）的分类器是胃癌患者生存和复发的独立预后标志物［30，40］。胃癌复发的风险评分公式是以个人为基础建立的（1.434×circRNA101308的状态）-（0.917×circRNA104423的状态）-（1.042×cir⁃cRNA104916的状态）-（1.201×circRNA100269的状态），其中高表达状态等于1而低表达状态等于0。临界值是由X-tile软件计算的“-1”。当危险评分高于临界值时，将患者纳入高危组。否则，患者被纳入低风险组。使用这个分类器，我们可以从高风险的胃癌患者中区分早期复发风险低的患者。

3.4 作为胃癌生物标志物生物标志物被定义为可以在血液，体液或组织中发现的生物实体，其可以是正常或异常过程或病症或疾病的征兆。生物标志物的使用已经成为早期检测和诊断不同疾病以及衡量对某些治疗方法的反应的手段。以下几个特征使其适合临床使用，①稳定的结构：大多数circRNA显示出半衰期48 h，mRNA的平均半衰期为10 h［41］。不像线性 RNA，3′和 5′末端不暴露在 cir⁃cRNA中；因此，它们对核糖核酸酶（如核酸外切酶或核糖核酸酶R）不敏感，并且具有较长的半衰期；②组织特异性：根据动物实验，来自Rmst和Klhl2的环状RNA在小鼠脑中高度表达，但不在肝脏或肺中表达［42］。由于其独特的结构，circRNA在组织、血清、尿液中更稳定，从数千个circRNA筛选敏感和特异性分子生物的可能性也更大。通过RT-PCR和原位杂交测试circRNA也比通过抗原-抗体反应检测蛋白质更灵敏，与相邻非肿瘤组织相比，circRNA在胃癌组织中上调或下调，通过将其与各种其他生物标志物组合，从而提高诊断的准确性和特异性。

3.5 可能作为胃癌靶向治疗目标肿瘤直径、淋巴结转移、TNM分期及远处转移是影响肿瘤患者结局的重要因素，而circRNA与胃癌上述临床病理因素相关，大胆预测各种CircRNA可作为胃癌治疗的靶点，要么减少功能转录物的循环，要么使用“mRNA陷阱”来阻断转录本中功能失调的外显子［18，41］。在细胞中循环miRNA海绵是基于RNA的癌症治疗新的候选者。研究人员最近报道，一种环状的人造miRNA海绵可能会诱导癌细胞中的miRNA功能丧失［43］。Liu等［43］构建了包含来自T4噬菌体基因td的第I组内含子的置换的内含子-外显子序列并产生针对miR-21和miR-221的环状miRNA海绵的环状miRNA海绵表达载体。作为表达线性海绵的替代载体，本研究中描述的RNA的表达载体开辟了新的方式来提供具有持久效应的miRNA海绵，并且具有巨大的癌症研究和治疗潜力。ciRS-7作为强有力的环状miR-7海绵起作用，其含有多个结合miR-7的miRNA反应元件［44］。因此，它可以瞬间结合或释放大量的miR-7分子，从而有效调节疾病网络［45］。由此可以看出，虽然靶向circRNA与人类疾病尚处于起步阶段，但随着对circRNA研究的深入，肯定会为胃癌的靶向治疗提供新的理论依据。

4 结语与展望

CircRNA是近年来发现的新型分子。它们不再被认为是转录错误的产物。相反，由于其重要的功能，它们已成为miRNA和lncRNA后最受欢迎的研究课题［46］，它们可能在基因表达和信号通路中发挥重要作用，并参与一些疾病的发展。如上所述，circRNA已显示出巨大的疾病诊断与治疗的潜力［47］。目前，临床中使用的分子生物标志物总是具有低器官特异性。例如，CEA在消化道肿瘤中很常见，而CA19-9在各种腺癌中很常见。如果将cir⁃cRNA作为胃癌的生物标志物用于临床，它们的特异性表达可能有助于解决现有标志物的低器官特异性问题。然而，circRNA在诊断上也具有一些缺点。首先，检测组织或外泌体中的circRNA比现有检测更昂贵，这限制了circRNA作为生物标志物的广泛使用；第二，使用circRNA进行诊断的可靠性仍然需要被证明。现在尽管对circRNA的产生及其确定的功能有了初步的了解，但仍需要大量的研究，相信在不久的将来circRNA会在胃癌预防、诊断和治疗中发挥越来越重要的作用。