儿童原发性肾病综合征患者尿液外泌体miR-23b-3p水平变化及其临床意义*

张翠平，陈婷婷，王 成，于汉卿，张辰宇，张春妮

(1.南京大学医学院附属金陵医院，解放军东部战区总医院临床检验科，南京 210002；2.南京医科大学附属儿童医院，南京 210008；3.南京大学生命科学学院，南京 210046)

原发性肾病综合征(nephrotic syndrome，NS)是儿童期最常见的肾小球疾病，发病机制不清。目前多认为是由肾小球基底膜通透性增高，大量血浆蛋白从尿中丢失导致，临床主要表现为大量蛋白尿、低清蛋白血症、水肿和高胆固醇血症，易复发及并发感染等。若不及时治疗，将有感染、血栓栓塞甚至发展为肾衰竭的危险。外泌体(exosome)是细胞分泌的直径约50～150 nm的膜性囊泡，内含来源细胞特异性的蛋白、脂质和核酸(包括miRNA，mRNA)等物质，通过血液和体液循环，参与重要的细胞间交流和生物活性物质转运。外泌体miRNA不但可以反映来源细胞的病理生理状态，而且在多种病理生理过程中发挥重要作用[1，2]。研究表明，血液和体液外泌体中的miRNA的丰度和稳定性均高于游离的miRNA，提示外泌体中的miRNA作为标志物将更为可靠[3]。有报道显示，miR-23b-3p是一种高表达于足细胞的miRNA，其缺失将会引起蛋白尿以及肾小球和肾小管的损伤[4]。因此，本研究拟通过检测miR-23b-3p在NS患儿尿液外泌体中的水平，探讨其作为NS辅助诊断指标的可能性。

1 材料和方法

1.1 研究对象 收集2017年3～11月在解放军东部战区总医院(原南京军区南京总医院)儿科确诊并住院的98例NS患儿治疗前尿液标本(晨尿)，其中男性71例，女性27例，平均年龄6.5±3.6岁。其中41例患儿同时收集其治疗后尿蛋白转阴的晨尿。NS患儿纳入标准：所有患儿年龄均<15岁，尿蛋白>50 mg/kg/day，排除先天性或继发性肾病综合征、其他肾脏疾病、尿路异常或感染及其他疾病等。所有患儿均接受激素和其他常规辅助治疗，包括降压药、利尿药等，部分使用环孢素、环磷酰胺、他克莫司及麦考酚吗乙酯等。同期在南京医科大学附属儿童医院收集95例常规体检正常的儿童为对照组，女性27例，男性68例，平均年龄5.7±3.1岁。两组之间性别、年龄差异无统计学意义(P=0.893，0.382)。本研究经医院医学伦理学委员会批准，所有样本的收集均获得患儿父母知情同意。

1.2 仪器和试剂

1.2.1 仪器：5418型高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；SAS67120型超纯水机(美国Millipore公司)；2720型PCR仪(美国ABI公司)；LightCycler®96实时荧光定量PCR仪(瑞士Roche公司)；7600型全自动生化分析仪(日本Hitachi公司)。

1.2.2 试剂：ExoQuick尿液外泌体分离试剂盒(美国SBI公司)；Trizol试剂(美国Life Technologies公司)；分析纯级别氯仿、异丙醇、无水乙醇(上海国药集团试剂公司)；DEPC水(美国Sigma-Aldrich公司)；miR-23b-3p逆转录引物、qRT-PCR引物及TaqMan探针(美国ABI公司)；逆转录体系和qRT-PCR体系所用试剂、miR-23b-3p成熟体(大连TaKaRa公司)；血清总蛋白(total protein，TP)和清蛋白(albumin，Alb)检测试剂盒(北京Leadman公司)；血清总胆固醇(total cholesterol，TC)和三酰甘油(triacylglycerols，TG)检测试剂盒(英国Randox公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 标本收集及处理：收集NS患儿入院治疗前及健康对照者的晨尿8 ml，室温下3 000×g离心10 min，除去细胞及细胞碎片，收集离心后的上清，于-80℃冰箱保存。

1.3.2 尿液外泌体提取：将尿液标本在4℃，3 000×g离心30 min，取500 μl上清液，根据外泌体提取试剂盒说明书加入100 μl ExoQuick试剂，混匀离心提取外泌体。

1.3.3 外泌体总RNA提取：按本课题组前期建立的方法[5]，用Trizol法提取外泌体中的总RNA，使用20 μl的DEPC水溶解保存于-80 ℃待用。

1.3.4 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)：基于TaqMan探针的qRT-PCR方法检测尿液外泌体miR-23b-3p水平[6]。①逆转录PCR反应体系为10 μl：DEPC水3.5 μl，5×逆转录缓冲液2.0 μl，10 mmol/L dNTPs 1.0 μl，AMV逆转录酶0.5 μl，miR-23b-3p逆转录引物1.0 μl，RNA样品2.0 μl。反应条件为 16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min，4℃保存，每个反应均为一个循环。②qRT-PCR反应体系为20 μl：ddH2O 14.77 μl，10×PCR缓冲液2 μl，25 mmol/L MgCl21.2 μl，10 mmol/L dNTP 0.4 μl，rTaq酶0.3 μl，miR-23b-3p上下游引物和TaqMan探针0.33 μl，cDNA 1 μl。反应条件为95℃ 5 min，1个循环；95℃ 15 s，60℃ 1 min，共40个循环。③标准曲线：将浓度为1 μmol/L的miR-23b-3p成熟体逆转录成cDNA，进行一系列浓度梯度稀释(1～109fmol/L)作为标准品与待测miR-23b-3p同时进行qRT-PCR定量。通过仪器配套的LightCycler®96分析软件对测定结果设定统一的阈值，分析获得检测的Ct值。然后，以一系列标准品浓度的对数为X轴，每个浓度检测的Ct值为Y轴绘制标准曲线。最后根据标准曲线计算每个待测样本中外泌体miR-23b-3p的含量。每个样本做3个复孔，结果取均值。同时，以不含RNA模板的ddH2O作为阴性对照。

1.3.5 尿蛋白和血清学指标测定：尿常规尿蛋白测定用干化学法；血清Alb，TP，TC，TG用日立7600型全自动生化分析仪进行定量检测。

2 结果

2.1 尿液外泌体miR-23b-3p水平检测 qRT-PCR结果显示，NS患儿尿液外泌体中的miR-23b-3p水平为13.44(4.47，31.40)fmol/L，显著高于健康对照组3.94(2.76，7.15)fmol/L，差异具有统计学意义(U=1 899，P<0.000 1)。见图1。

***代表Mann-Whitney非参数检验，P<0.001。

2.2 NS患儿治疗前后尿液外泌体miR-23b-3p水平变化 利用qRT-PCR检测41例NS患儿治疗前和治疗后(尿蛋白转阴)尿液外泌体miR-23b-3p水平，并分析其变化特征。Wilcoxon matched pairs检验结果显示，治疗后NS患儿尿液外泌体miR-23b-3p含量较治疗前明显下降[10.62(4.38，37.72)fmol/L vs 2.84(1.53，4.92)fmol/L]，差异具有统计学意义(W=695，P<0.000 1)。

2.3 ROC曲线分析 ROC曲线分析显示尿液外泌体miR-23b-3p能够较好地区分NS患儿和正常对照，其AUC为0.796(95%CI：0.734～0.858)，见图2A。当cutoff值为4.26时，miR-23b-3p诊断NS的敏感度为84.7%，特异度为64.2%。此外，miR-23b-3p在区分治疗缓解后患儿的AUC为0.830(95%CI：0.742～0.917)，见图2B。在cutoff值为6.96时，其敏感度为65.9%，特异度为90.2%。

图2 血清miR-23b-3p诊断NS患儿与正常对照(A)和NS患儿治疗缓解后(B)的ROC曲线分析

2.4 单因素逻辑回归分析 以健康对照为二分类参考变量，进一步采用单因素逻辑回归分析尿液外泌体miR-23b-3p与NS发病的相关性。结果显示，miR-23b-3p是NS潜在的发病风险因子[OR=7.565(95%CI：2.784～20.555)，P<0.000 1]。

2.5 miR-23b-3p水平与NS患儿生化指标的相关性分析 Spearman相关性分析显示，NS患儿尿液外泌体miR-23b-3p水平与血清TP，Alb含量呈显著负相关(r=-0.377，P=0.000 1；r=-0.309，P=0.002)；与TC，TG含量呈显著正相关(r=0.266，P=0.009；r=0.318，P=0.002)，差异均有统计学意义(P<0.01)；与性别和年龄无相关性(r=-0.101，P=0.321；r=0.044，P=0.676)。

3 讨论

目前，临床上主要依靠肾组织活检、尿蛋白和血清生化指标对NS患儿进行诊断和监测随访。肾组织活检是病理诊断NS的金标准，但却是一种创伤性的手段，且有很多潜在的并发症，不适用于儿童的连续监测。尿蛋白定量受饮食、检测方法等其他因素影响，血清生化指标也会受到机体多种因素的干扰[7]。因此，亟需寻找和鉴定新的、具备较高临床诊断价值的NS非侵入性指标。

本课题组曾对NS患儿血液和尿液中的miRNA进行测序及定量分析，发现NS患儿血清miR-30a-5p，miR-151-3p，miR-150，miR-191，miR-19b和尿液中的miR-30a-5p含量均明显高于正常对照，可作为NS患儿诊断及预后的潜在指标[8]。包裹在外泌体中的miRNA的稳定性远高于游离miRNA[3]，其与疾病的关系也更为密切，是目前疾病液体活检领域研究的热点。据文献报道，尿液中的外泌体均来源于肾组织，外泌体所包含的物质能够更早更准确地反映肾脏疾病的状态及进展[9]，且尿液具有样本量大、易收集、无创性等优点，故尿液外泌体具有作为肾脏疾病诊断及疗效监测的潜能。MIRANDA等[10]研究发现，尿液外泌体所包含的RNA不仅稳定，而且能够反映肾组织和细胞的RNA表达情况及其生理病理变化。HUANG等[2]发现尿液外泌体miR-193a在局灶性节段性肾小球硬化症(focal segmental glomerulosclerosis，FSGS)患者中显著升高，具有作为FSGS 潜在的新型生物学标志物的潜能。LI等[11]也证实了在IV型狼疮性肾炎患者尿液外泌体中miRNA表达谱(miR-3135b，miR-654-5p和miR-146a-5p)具有特异性。这些研究揭示了尿液外泌体中的miRNA可以辅助诊断不同类型的肾脏疾病。

目前，NS患儿尿液外泌体miRNA的研究才刚刚起步，miRNA检测对于NS的临床价值及其可能分子机制尚不完全清楚。大多数研究认为NS的发病机制主要与足细胞的损伤或突变导致肾小球基底膜通透性增加以及免疫失调等因素有关[12-13]。HO等[4]发现miR-23b-3p在足细胞高表达，足细胞Dicer酶特异性敲除后miR-23b-3p的缺失将会引起蛋白尿以及肾小球和肾小管的损伤，提示miR-23b-3p具有维持肾小球基底膜完整性的功能。另有研究证明miR-23b-3p介导的信号通路能够在转录水平下调靶基因Hes1的表达[14]，而Hes1参与肾单位的形成并且是肾形成过程中激活的Notch信号通路的下游靶点[15]，间接证明了miR-23b-3p的变化与肾小球疾病密切相关。为此，我们对NS患儿尿液外泌体中的miR-23b-3p进行检测分析，结果发现，miR-23b-3p在患儿尿液外泌体中的含量显著升高，而在治疗缓解后明显降低。尿液外泌体miR-23b-3p水平与NS患儿血清TP和Alb含量呈显著负相关，而与TC，TG含量呈显著正相关关系，逻辑回归分析揭示miR-23b-3p是NS潜在的危险因子。这些结果提示，miR-23b-3p是儿童NS潜在的辅助指标，若与现有的实验室指标联合检测，将有助于提高该病的诊断和监控能力。

miR-23b-3p在NS患儿尿液外泌体中升高的原因和机制尚不明确。我们推测可能与NS病人肾小球足细胞损伤有关，富含miR-23b-3p的足细胞在受到损伤后，导致以外泌体形式主动分泌的miR-23b-3p增加，使得外泌体miR-23b-3p在尿液中含量升高。不过，这还需深入研究以证实。

综上所述，我们发现了NS患儿尿液外泌体中miR-23b-3p水平显著增加，且随着疾病的缓解而降低，可作为儿童NS潜在的液体活检指标。本研究为该病的诊断提供了新的手段和思路，也为探究尿液外泌体miRNA在肾小球疾病中的作用提供了线索。