介孔硅材料在止血应用方面的研究进展

丁 晟，李 钒，杨 焜，王春来，田 丰

(军事科学院系统工程研究院卫勤保障技术研究所，天津 300161)

0 前言

过度失血是当前战争和院前急救中引起伤员死亡的主要原因，使用适当的止血器材进行急救处理，可以有效减少战斗伤亡。由于止血带在人体除四肢之外的部位应用往往受限，因此快速止血材料一直是急救领域研究的热点。美军根据近年来不断的战争实践经验[1-2]以及综合实验评价，推荐使用以高岭土为止血功能核心的战斗止血纱布(Combat Gauze)。但由于成分复杂的硅铝酸盐无机止血材料(如沸石[3-6]、蒙脱石[7-8]、高岭土[9]等)存在一定安全隐患，近年来，成分可控且结构类似的介孔二氧化硅材料(简称介孔硅)受到越来越多的关注，并已经在止血应用方面展现出巨大的潜力。

1 介孔硅材料的特点及应用范围

介孔硅是孔径在2～50 nm范围的二氧化硅材料，往往具有较大的比表面积和孔容、良好的生物相容性、可控的孔径以及有序可调的孔道结构等特性，使其在生物医学应用中表现出卓越的效果。介孔硅的常见应用有：药物载体、骨修复材料、止血材料、水污染防治，催化领域等。

介孔硅独特的结构和良好的生物相容性使其常用于负载药物、基因、生物分子如酶、蛋白质等。此外，介孔硅可以吸附水体中的有机物和去除重金属离子，从而用于水污染的防治。介孔硅还可以进行金属离子的改性进而应用于催化领域。近年来，介孔硅大的比表面积和孔容使其在止血方面也得到了很好的应用。研究发现，人工合成的介孔硅所具有的多孔结构、大比表面积，高容积率等特性，使其本身可以通过良好的吸附能力，快速吸收血液中的水分从而浓缩了局部创面的凝血成分，最终实现快速止血的目的。由于成分可控，止血效果显著，以介孔硅为功能核心的止血材料研究已引起了众多国内外研究者的关注。除了介孔硅自身的微观结构、表面功能化改性等研究之外，研究者还通过介孔硅负载其他止血药物，或与其它材料复合来进一步提高止血材料的性能。本文主要介绍了介孔硅材料在止血应用方面的研究进展。

2 介孔硅材料的类型及合成方法

从形态来分类，介孔硅材料的常见类型有介孔硅干凝胶、介孔硅气凝胶、介孔硅泡沫、介孔硅纳米颗粒、介孔生物活性玻璃等，目前主要用于生物医学领域的是介孔生物活性玻璃和介孔硅纳米颗粒。

介孔硅材料主要的合成方法有：溶胶凝胶法和水热合成法。溶胶-凝胶法主要是通过不同类型的模板剂(例如表面活性剂、嵌段共聚物模板或者有机小分子模板等)所形成的超分子胶束作为模板，通过溶胶—凝胶的过程，在无机物和有机物之间的界面定向引导作用之下自组装制备成介孔硅材料。水热合成法是将一定量的表面活性剂、酸或碱加入水中形成混合溶液，然后再引入硅源，在高温高压的条件下进行合成反应，所得产物分散性好、粒度可控、纯度较高。如表1所示为不同类型的介孔硅材料常见的合成方法。

表1 不同类型介孔硅材料的合成方法

3 介孔硅材料的止血应用

近年来，外军使用的先进无机类止血材料主要有QuikClot、CombatGauze和WoundStat(见表2)，其主要止血功能成分别为沸石、高岭土和蒙脱石。研究显示，3种产品的止血效果按照强弱依次排序为WoundStat>CombatGauze>QuikClot[18-20]。上述止血材料都是利用了硅铝酸盐材料的多孔结构，大比表面积和良好的吸附能力，这些为介孔硅材料在止血方面的应用研究提供了依据。人工合成的介孔硅材料在具有这些上述良好的性能特性之外，相较于天然硅铝酸盐材料更具有成分、粒径、孔径可控等优势，有望成为一种理想的急救止血材料，目前已成为快速止血材料应用研究方面的一个热点。

表2 外军使用的几种先进的无机止血材料

3.1 介孔硅材料的止血研究

图1 硅基干凝胶的TEM照片[10]Fig.1 TEM image of silica-based xerogel

介孔硅由于其独特的结构特性和良好的吸水性能使其本身就具备了良好的止血能力。李晓生等[10]331使用溶胶-凝胶工艺方法合成的具有纳米介孔结构的硅基干凝胶(如图1所示)表现出了良好的止血性能，通过活化部分凝血活酶时间(APTT)和凝血酶原时间(PT)体外凝血实验发现介孔硅干凝胶能够明显的促进内、外源性凝血因子的活性；在兔耳缘静脉止血实验中，将其与云南白药进行止血效果的对比，研究发现介孔硅干凝胶具有更短的凝血时间和更好的止血性能，此外，对比使用云南白药后伤口水分较多会造成红肿的现象，由于介孔硅干凝胶良好的吸水性能，可以使伤口很快的干燥并保持一定湿度，而不会造成伤口的红肿。王立群等[21]通过溶胶-凝胶工艺方法合成了介孔二氧化硅微球，并通过APTT和PT来测试其对内、外源性凝血系统的影响，研究发现，与非孔氧化硅对比，介孔二氧化硅APTT和PT的凝血时间明显减少，同时在兔背部以及肝脏止血性能对比中，介孔二氧化硅流血时间明显减少，表现出良好的止血性能。Dai等[22]5 368-5 369通过改进的溶胶-凝胶法制备了介孔硅材料MSS，并通过血栓弹力图分析、体外凝血实验的APTT和PT测试以及血小板吸附实验，发现MSS能显著减少止血所需时间和增加血小板的吸附量，显示出了很好的止血性能。

虽然介孔硅材料本身就具有一定的止血性能，但是研究人员通常还会将其与其他材料进行复合，进一步提升介孔硅的止血性能，并赋予介孔硅材料更多的功能性。

3.2 介孔硅与有机材料的复合研究

3.2.1 介孔硅与壳聚糖复合研究

介孔硅作为无机类物质优化后的产物虽然具有比有机类止血材料更好的止血性能，但是其容易残留脉管内引起血栓，并且生物相容性也不如有机类止血材料优秀。而壳聚糖作为传统的有机止血材料具有着良好的止血性能和生物相容性一直受到人们的广泛研究，同时壳聚糖良好的黏附性能可以使其能黏附组织以及防止壳聚糖残留在体内。因此，许多研究人员将两者进行复合来弥补单一材料的不足，制备了一系列介孔硅与壳聚糖复合止血材料。

(a)M58S的TEM照片 (b) 60 %M58S/CS多孔膜的SEM照片图2 M58S和60 %M58S/CS多孔膜的SEM照片[25]Fig.2 TEM image of M58S and SEM image of 60 %M58S/CS composite porous[25]

Park等[23]将壳聚糖通过溶胶-凝胶法与二氧化硅干凝胶复合制备出壳聚糖-二氧化硅(CTS-Si)海绵的伤口敷料，用于促进伤口的愈合。通过动脉出血模型测量发现，将纱布作为对照组相比，使用CTS-Si的总失血量和止血时间均显著降低(分别降为40 %和20 %)。因此，CTS-Si敷料海绵材料应用于止血和伤口愈合具有着巨大的潜力。Dai等采用改进的溶胶-凝胶法以及PEG分子印迹技术[24]，制备了介孔二氧化硅干凝胶并将其与壳聚糖进行杂交最终研制出壳聚糖包覆的介孔二氧化硅干凝胶微珠(CSSX)微珠，并且通过体外和体内凝血性能评价，优化CSSX微珠的结构特性，发现用体积分数分别为2 %的壳聚糖和5 %的聚乙二醇(PEG)制备的CSSX微珠止血效果最佳。CSSX微珠通过组织学检查没有产生放热反应和后续组织热损伤，且在7 d后也没有表现出明显的细胞毒性。贾天保[25]通过冷冻干燥的方法，将介孔生物活性玻璃(M58S)和壳聚糖(CS)复合制成了复合多孔膜止血材料(如图2所示)。在动物止血实验中，对比了不同介孔生物活性玻璃含量的复合膜以及纯介孔生物活性玻璃粉和沸石的止血效果，实现发现随着介孔生物活性玻璃含量的增加，复合膜的止血性能越好，含60 %(质量分数，下同)介孔生物活性玻璃的复合膜的止血性能最佳，止血时间和出血量最少；其次，虽然纯介孔生物活性玻璃粉止血性能弱于多孔膜但是却优于沸石的止血性能。TraumaStat是一种结合了介孔硅，壳聚糖和聚乙烯材料的新型复合止血产品，Francoise等[26]通过使用猪股动脉横断模型来比较CombatGauze和TraumaStat的止血性能，研究结果发现这2种材料的止血性能同样的优秀。而Sambasivan等[27]将TraumaStat与ChitoFlex和标准纱布的止血效果进行对比，研究结果表明，TraumaStat能够显著提高动物存活率，在减少失血量和输液量等方面有明显的优势。Englehart等[28]将TraumaStat与HemCon和纱布敷料的止血性能进行对比,通过对比研究猪严重失控性出血的致死腹股沟损伤模型中止血效果发现，TraumaStat导致的止血效果明显优于HemCon和纱布，与HemCon和纱布敷料相比，TraumaStat能够改进止血性能，有效减少失血量，其显著增加的表面积和更合适的结构特性能够增强血液和凝血因子相互作用，从而产生更强、更多的止血凝块。

本课题组前期研制了具有大孔的介孔纳米颗粒(MSN),并将其与甘油修饰的N-烷基化壳聚糖(GACS)复合[29]，研制了一种新型的快速止血海绵(如图3所示)。通过多种体外凝血试验(包括临床基本血凝检测、血栓弹力图测定、血小板黏附测定、血液吸收率测定)表现出了优良的止血性能。除了能够增强血小板黏附和全血吸收外，通过溶血试验分析了血液生物相容性，与CombatGauze相比，止血海绵显示出了更低的溶血率，说明止血海绵的血液相容性比CombatGauze更好；通过细胞毒性检测，使用CCK-8细胞毒性检测和死/活活力测定法来测定细胞活力，发现止血海绵对细胞活力几乎没有影响，而CombatGauze有着显著的抑制细胞增殖的情况。因此，与CombatGauze相比，止血海绵具有极好的生物相容性。此外，在兔股动脉和肝脏损伤体内模型的止血研究中，对比了CombatGauze、纱布和止血海绵的止血性能，其中止血海绵显示出更高效的止血性能和更低的细胞毒性。

(a)实物照片 (b) SEM照片图3 MSN-GACS止血海绵和其SEM照片[29]Fig.3 MSN-GACS sponge and its SEM image[29]

3.2.2 介孔硅与其他有机材料的复合研究

除了将介孔硅与壳聚糖进行复合外，越来越多的研究者开始将介孔硅与其他有机材料进行复合，来达到增强止血性能、提高生物相容性、提供抗菌性能等目的。

Hillis等[30]将一种由纤维素、二氧化硅组成的新型止血产品NuStat与Combat Gauze进行比较，在应用于穿透性猪股动脉腹股沟损伤时，研究发现它在实现长期止血以及在预防止血材料应用后的再出血时与Combat Gauze的效果相同。因此，在战斗和民用紧急医疗服务环境中NuStat NS作为止血产品具有很好的应用前景。Tansaz等[31]将生物活性玻璃与大豆分离蛋白进行复合制备了一种新型的生物可降解薄膜止血材料。通过止血性能研究发现，在加入生物活性玻璃后，与纯大豆分离蛋白(SPI)薄膜相比，材料凝血功能得到了增强，凝血速度更快；并且通过细胞培养发现，细胞在含有生物活性玻璃的SPI薄膜上可以更好的生长，因此材料具有很好的生物相容性，此外，材料的力学性能也得到了增强，在应用于伤口敷料上具有很好的前景。李静静等[32]在制备了介孔生物玻璃M58S的基础上通过冷冻干燥法制备了介孔生物玻璃/丝素蛋白复合多孔海绵止血材料M58S/SF，并且通过体外凝血实验的APTT和PT测试结果(如图4所示)发现该复合多孔海绵主要是通过作用于血液的内源性凝血系统途径促进凝血；通过大鼠肝脏止血模型比较复合材料与明胶海绵的止血性能，发现当介孔生物玻璃含量高于15 %时，复合多孔海绵的止血效果优于明胶海绵；通过研究复合多孔海绵对L929大鼠成纤维细胞相对增殖率的影响，发现L929细胞不受材料的影响，该复合多孔海绵止血材料细胞相容性好，没有细胞毒性。Zhou等[33]将介孔硅与海藻酸钙进行复合开发了一种新型的基于介孔二氧化硅(MS)的海藻酸钙纳米复合止血颗粒(p-MS/CA)用于控制出血。制备的纳米复合止血颗粒的尺寸为2～3 mm，具有粗糙和大孔表面使其具有很好的吸附性能，材料能够显著加速水吸收并封堵受损组织，从而有效促进血小板和血浆蛋白黏附，增强伤口黏附，促进凝血级联的接触激活途径，具有理想的止血作用。通过体外和体内的止血试验发现，纳米复合止血颗粒均可加速止血、减少止血时间和失血量。同时，在生物相容性方面，p-MS/CA的纳米复合材料表现出优异的细胞活力并且不会诱导溶血。此外，在拥有优越的止血性能的同时，该纳米复合材料的制备成本较低，能够快速且易于实现大规模的生产，因此具有着巨大的商业和临床应用潜力。

(a)APTT (b) PT(与对照组相比*p<0.05，n=3)图4 多孔复合海绵的APTT(a)和PT(b)测试结果[32]Fig.4 Changes in APPT and PT for rat plasma with composite sponges

图5 含介孔二氧化硅负载姜黄素的纳米纤维垫制备示意图[34]Fig.5 Preparation schematic of the formation of curcumin-loaded mesoporous silica incorporated nanofiber mats

Li等[34]用介孔二氧化硅负载姜黄素与聚乙烯吡咯烷酮共混电纺丝制备了纳米纤维垫，来用于伤口的快速止血和抗菌，制备示意图如图5所示。通过研究发现，纳米纤维垫对细胞的生长没有明显的毒性作用，并且能够增强对金黄色葡萄球菌的体外抗菌作用。此外，通过体内止血研究发现，混合纳米纤维垫在与血液接触时可迅速转变为水凝胶，然后激活凝血系统以阻止伤口出血。因此，该材料具有良好的生物相容性和高抗菌活性。Wang等[35]用介孔二氧化硅纳米粒子(MS)负载本身可作为止血剂的单宁酸(TA)，通过共价共轭和静电吸附来控制出血和进行有效的抗菌。特别是使用制备的15TMS，可以将体外和体内止血时间缩短65 %，降低失血量，并对金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌具有更好的抗菌活性，有助于促进伤口的愈合。

3.3 介孔硅与金属离子材料的复合研究

除了将介孔硅与壳聚糖等有机材料进行复合来弥补作为止血材料自身生物相容性的不足之外，为了满足抗菌防感染的需求，制备具有既有止血有抗菌性能的新型止血材料，许多研究者引入了其他具有抗菌性能的材料进行复合，达到既能止血，又能抑菌抗感染的效果。目前研究中与介孔硅复合的常见金属离子有银离子、钙离子和镓离子。

3.3.1 银离子

在抗菌性能的研究方面，研究最多的就是银离子。人们普遍认为银具有广谱的抗菌活性，对革兰氏阳性菌、革兰阴阳性菌、真菌和部分病毒等均具有抗菌作用，甚至对耐药菌株都能够显示出很强的抗菌作用。Ambrogi等[36]将SBA-15型介孔硅负载纳米银粒子(AgNPs)与壳聚糖复合制备出含SBA-15-AgNPs的壳聚糖薄膜敷料，并且研究发现该薄膜敷料显示出了良好的力学性能、吸水性、蒸气透过性和抗微生物活性。研究发现，含有AgNPs的壳聚糖膜显示出对革兰氏阳性金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌以及对绿脓杆菌明显的抗微生物活性。Nie等[37]通过一锅溶胶凝胶法成功合成了掺入AgNP的介孔硅颗粒(MSG)。他们通过研究发现5 % AgNP-MSG具有良好生物相容性以及有效的止血和更强的抗菌活性，并且通过使用急性出血肝脏模型的止血试验发现5 %AgNP-MSG仅在7 s内就可以形成凝块，这凝血速度远远快于商业衍生的止血纱布。因此通过微调掺入的银含量，十分有希望将掺入AgNP的MSG开发为具有良好抑菌止血性能的止血药剂。Lu等[38]设计并制造了一种能够生物降解和具有良好生物相容性的纳米银装饰的介孔二氧化硅纳米粒子Ag-MSNs(如图6所示)用于皮肤的伤口愈合。研究发现Ag-MSNs对革兰氏阴性菌、大肠杆菌和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌均显示出优异的抗菌活性。并且Ag-MSNs在大鼠动物实验模型中伤口愈合效果更好和更加美观，而且不会引起任何感染或副作用。

(a) MSNs (b) Ag-MSNs图6 MSNs和Ag-MSNs的TEM照片[38]Fig.6 TEM images of MSNs and Ag-MSNs[38]

3.3.2 钙离子

在凝血过程中，钙离子作为参与反应的13个凝血因子之一，在凝血过程中起到了很大的作用。钙离子(凝血因子IV)可以帮助诱导内源性凝血级联与其他凝血因子的活化和更新，从而加速产生足够量的凝血酶以支持早期的纤维蛋白生成。钙离子可以促进血液的凝结反应，催化血液中纤维蛋白原转化为纤维蛋白，有利于纤维蛋白的连锁聚合反应和血液凝结的稳定性，而众多纤维蛋白可以组成血凝块，从而堵住创面裂口。Dai等[22]5 371通过使用介孔硅来负载Ag和Ca制成粉剂和颗粒状止血剂AgCaMSS后进行止血和抑菌性能的评测。研究发现含Ca的MSS(CaMSS和AgCaMSS)可以通过缩短初始凝血酶产生的时间以及凝血酶产生峰值的时间来特异性激活接触途径；含Ag的AgCaMSS对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都具有很好的抗菌活性，特别是大对肠杆菌菌，具有很强的抗菌活性。与MSS相比，AgCaMSS能显著激活凝血级联的内在通路，能够激活更多的血小板黏附并吸附更多量的血小板黏附在其表面上从而促进凝血，在兔股动脉出血模型(如图7所示)和肝损伤实验中显示出很好的止血性能。陈于等[39]通过使用溶胶-凝胶法来合成掺杂钙银的介孔氧化硅凝胶(m-SCA)抗菌止血材料,研究发现m-SCA具有很好的止血性能,在兔耳缘静脉止血实验中能发现其够阻止伤口流血并缩短流血时间，其中的钙对止血起了很大的作用。此外，含Ag0.02 %的m-SCA对大肠杆菌有明显的抑菌性能。

(a)切开皮肤和肌肉覆盖下的股动脉 (b)切开动脉后大出血 (c)吸取涌出的血液后将AgCaMSS覆盖于腹股沟腔内 (d)在手工按压伤口后停止出血图7 兔股动脉损伤止血实验[22]Fig.7 Hemostasis experiments on rabbit femoral artery injury[22]

3.3.3 镓离子

近年来，Ga3+应用于止血方面的研究开始引起人们的兴趣。因为Ga3+有益于治疗局部感染，抑制生物膜形成并赋予游离活细菌和生物膜细胞杀菌活性[40]。此外，Ga3+离子对革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和艰难梭菌)和革兰氏阴性菌(大肠杆菌和绿脓杆菌)均具有抗菌活性[41-42]。在具有抗菌性能的同时，Ga3+还对止血有着很好的促进作用。Xu等[43]研究了硝酸镓在烧伤创面感染中的抗微生物作用，并用微生物活力测定试剂盒Kit-WST测定了硝酸镓对感染烧伤中常见细菌的最小抑制浓度(MIC),研究发现硝酸镓革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有很好的抗菌活性。研究发现硝酸镓Ga(NO3)3水溶液，当直接应用于开放性伤口时，似乎可以有效地立即治疗伤口和增强止血的早期阶段(凝血、血小板活化或凝块形成)。Goodley和Rogosnitzky[44-45]等研究了Ga(NO3)3溶液对开放性伤口流血的止血活性，并得出结论，该溶液有存在显著的减少凝血时间的能力。Bauters等[46]发现硝酸镓溶液通过絮凝途径诱导全血样品中的纤维蛋白原沉淀，并且这种行为似乎取决于溶液中镓离子的存在。通过这个发现可以解释先前报道的关于硝酸镓的止血作用。尽管尚未充分了解Ga(NO3)3促进止血能力的确切作用机制，但该功能背后的主要原理可能取决于溶液中存在Ga3+。

Pourshahrestani等[47]制备了1 % Ga2O3-MBG，这是用于止血应用的Ga取代的介孔生物活性玻璃(MBG)的第一个实例，并评估了其抗出血作用以及生物相容性和抗菌性。通过各项性能测试材料表现出优异的止血抗菌性能和良好的生物相容性。研究结果表明，MBG中Ga2O3的比例是影响止血事件的关键参数。与MBG相比，1 %的Ga-MBG加速了内源性凝血级联，血栓形成和血小板黏附，而在较高比例下，Ga2O3对止血是无益的。所以，最低的Ga取代的MBG(1 %Ga-MBG)样品，结合了改进的止血性能，高降解性、高细胞相容性和对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性，可以作为控制出血和感染的止血剂的候选者。随后将这种含有1 %Ga2O3(1 %Ga-MBG)的介孔生物活性玻璃无机止血剂与2种商用止血剂CeloxTM(CX)和QuikClot(ACS +)进行了比较[48]。结果发现在1 %Ga-MBG和CX表面上比ACS+表面黏附了更多的血小板，而1 %Ga-MBG和ACS 比CX更能够促进血小板的活化。因此，1 %Ga-MBG能够聚集更多的的血小板和促进血小板的活化，在止血剂的应用上具有很好的前景。同时，研究发现Ga掺杂的MBG即使在3天后也显示出优异的细胞相容性，其中含1 % Ga2O3的MBG显示出最佳的生物相容性，使其应用于制备止血剂时具有很高的安全性。在此基础上，Pourshahrestani等[49]通过冻干工艺的方法，通过使用不同浓度(10 %、30 %、50 %)的Ga-MBG制备了含1 %Ga2O3的介孔生物活性玻璃-壳聚糖复合支架Ga-MBG/CHT(如图8所示)。与CXR相比，制备的复合支架表现出> 79 %的孔隙率并且表现出更强的水吸收能力。纯CHT和复合支架和CXR相比较有着更优的止血性能。与纯CHT制成的支架相比，具有最高Ga-MBG含量(50 %)的复合支架的血栓生成，血液凝固和血小板黏附和聚集的能力均有提高。50 % Ga-MBG/CHT的抗菌作用比CHT和CXR更明显。研究表明向MBG系统中加入较低的Ga2O3含量(1 mol%)改善了结构性能，包括比表面积，中孔尺寸和孔体积以及硅和钙离子的释放。发现生物活性玻璃刺激血液凝固，血小板黏附和血栓生成，并对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌产生抗菌作用。

(a)实物图 (b)TEM照片图8 Ga-MBG/CHT复合支架和其TEM照片[49]Fig.8 Ga-MBG/CHT composite scaffolds and its TEM image[49]

4 展望

创伤出血是平战时的常见伤情，介孔硅材料由于具有的大的孔容和比表面积等结构特性，使其在止血方面具有良好的应用前景。目前介孔硅材料的止血性能已经得到了验证，根据介孔硅材料的不足，设计其与有机材料或金属离子材料复合，都在一定程度上弥补了单一材料止血性能的不足，制备出兼备止血、抗菌等性能的多功能快速止血材料。然而介孔硅材料在复合过程往往牺牲一部分原有优势，如表面孔被堵塞、比表面积降低等。如何在保持介孔硅材料原有优势的同时，引入适当的复合成分，在提升止血性能的同时，兼备抗菌、防黏连、易清创等诸多创伤急救急需的功能，将是未来介孔硅材料在止血方面应用的研究重点。