一例腹腔浆膜炎型猪链球菌病的诊断与防治

蒋增海，王扬伟，张桂荣，邓同炜，卢建洲

（河南牧业经济学院动物医学院，河南 郑州 450046；河南省猪病防控工程技术研究中心，河南 郑州 450046）

猪链球菌病是链球菌属中马链球菌兽疫亚种、马链球菌类马亚种、Lancefied分群中D、E、L群链球菌以及猪链球菌引起猪的疫病的总称，临床上主要表现为淋巴结脓肿、脑膜炎、关节炎以及败血症等症状，其中，猪链球菌是世界范围内引致猪链球菌病最主要的病原[1]。

根据猪链球菌病荚膜多糖抗原的不同，可以将其分为35种血清型(血清型1～34和血清型1/2)，其中致病力最强的猪链球菌病2型是一种重要的人畜共患病病原，可通过呼吸道、消化道或皮肤伤口等途径感染人，从而对人类健康和生命安全构成潜在的危害[2]。在荷兰，猪链球菌2型引起各类临床症状中，42%为肺炎，18%为脑膜炎和心内膜炎，10%多发性浆膜炎[1]。猪链球菌病常常与其他猪病如巴氏杆菌病、副猪嗜血杆菌病、猪瘟、猪伪狂犬病等混合感染[3-7]，增加诊断难度，造成更为严重的危害。近年来，全国各地时常有猪链球菌病的报道[3-8]，但是未见腹腔浆膜炎型猪链球菌病的报道。

2018年5 月，河南新密某养猪场，饲养黑猪19头，体重40 kg左右，1周之内，连续5头仔猪发病，使用头孢噻呋钠，治愈3头，死亡2头。临床症状表现为精神不振，体温升高，呼吸急促，食欲下降，甚至不食，病初粪便干结，后期腹泻。病死猪剖解，可见颌下淋巴结、腹股沟淋巴结、肠系膜淋巴结肿大、出血（图1、图2），肺脏出血（图3），肝脏、脾脏、肠道表面大量蜘蛛网状的纤维素性物质覆盖（图4、图5）。为了诊断与控制该病，课题组采集病料，进行了细菌分离、鉴定及药敏试验，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

胰蛋白大豆琼脂（TSA）、胰蛋白大豆肉汤（TSB）、烟酰胺腺 嘌 呤 二 核 苷 酸（NAD）、5%鲜血琼脂平板、脑心浸液肉汤、2x PCR Taq Master Mix with dye、DNA Marker DL2 000、核酸染料、各种药敏片、快速革兰氏染色液。

1.2 细菌分离培养

无菌采集肺脏、心血，或者棉签直接涂抹肝脏或者脾脏浆膜面，接种于TSA琼脂平板（含终浓度为5%的新生牛血清、10μg/mL NAD），37℃培养24～48 h，进一步纯化传2～3代。将分离菌株，接种于血琼脂平板，37 ℃培养24～48 h，观察生长情况。

1.3 染色、镜检

取洁净玻片，滴一滴无菌蒸馏水于玻片中央，挑取纯化后的分离菌株单菌落，涂抹于蒸馏水中，混合，自然干燥后，火焰上固定，按照快速革兰氏染色说明书要求，进行染色。油镜下，观察分离菌株的形态特征。

1.4 PCR 检测

将分离菌株接种于TSB（含终浓度为5%的新生牛血清），过夜培养，水煮沸法提取分离菌株DNA模板。参考文献[9]合成一对链球菌扩增特异性引物（P1：GCAGCGTATTCTGTCAAACG，P2：CCATGGACAGATAAAGATGG，预期扩增片段大小为689 bp），采用PCR法对分离菌株进行特异性扩增，扩增产物在1%琼脂糖凝胶中电泳后，凝胶成像系统检测扩增条带与预期大小是否一致。

1.5 药敏试验

采用K-B纸片琼脂扩散法，对分离菌株进行药敏试验。将分离菌株接种于脑心浸液肉汤培养基中，37℃过夜培养。比浊法将菌液浓度，先调整为0.5麦氏单位（1.5×108CFU/mL）。用灭菌棉签，蘸取稀释好分离菌液，紧贴试管内壁在液体上方旋转拭子数次，这样能除去棉签上多余的液体，然后均匀涂抹于血琼脂平板，盖子可半开3～5 min，使得琼脂吸取多余水分。将药敏纸片贴于平板上，药敏片之间的距离以1～2 cm为宜，药敏纸片距平皿边缘约1.5 cm，置于37℃培养箱培养18～24 h后，测定抑菌圈的直径。参照2013版美国临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)手册解释标准[10]对药敏试验结果进行判定。

图1 颌下淋巴结肿大出血

图2 腹股沟淋巴结肿大出血

图3 肺脏出血

图4 肝脏、肠管覆盖纤维素性物质

图5 脾脏、肠管覆盖纤维素性物质

2 结果

2.1 细菌分离培养结果

无菌采集肺脏、心血，或者棉签直接涂抹肝脏或者脾脏浆膜面，接种于TSA琼脂平板，37℃培养24～48 h，生长为圆形、白色、针尖大小菌落，菌落很纯，无杂菌（图6）。将分离菌株，接种于血琼脂平板后，同样生长为圆形、针尖大小菌落，呈α溶血（草绿色溶血）（图 7）。

2.2 染色、镜检

将分离菌株革兰氏染色后，油镜下放大1 000倍观察，菌体呈革兰氏阳性，球形，链状排列(图8)。

2.3 PCR 检测结果

水煮法提取DNA模板，采用PCR法扩增猪链球菌特异性片段，扩增结果显示，扩增片段大小（图9）与预期大小689 bp一致，表明分离菌株为猪链球菌。

2.4 药敏试验结果

选取10种抗菌药物，采取K-B纸片琼脂扩散法，对分离菌株进行药敏试验。药敏试验结果表明分离菌株对青霉素类、四环素类药物、喹诺酮可药物、大环内脂内药物均敏感，对林可胺、氯霉素类药物耐药（表1）。通过药敏试验结果，我们可以看出，养殖户选择头孢噻呋钠治疗，应该是可行的，因为头孢噻呋钠一般比青霉素类药物更有效。

图6 TSA平板白色、圆形菌落

图7 血琼脂平板生长的圆形、白色、α溶血菌落

图8 分离菌株革兰氏阳性，球形，链状排列

图9 分离菌株PCR鉴定结果

表 1 分离菌株药敏试验结果

3 讨论与分析

猪链球菌病是一种人畜共患传染病，世界上广泛分布，在临床上主要引起败血型、脑膜炎型、关节炎型和淋巴结化脓型。本次病例，通过细菌分离、染色镜检形态观察和PCR检测，确诊为猪链球菌病；根据腹腔肝脏、脾脏和肠管覆盖大量纤维素性物质，判定为浆膜炎型猪链球菌病。该类型猪链球菌病，在临床上容易被误诊为副猪嗜血杆菌病，应引起广大兽医工作者和养殖户重视，注意鉴别诊断。

通过药敏试验，分离菌株对林可霉素和氯霉素耐药，由于氯霉素在我国禁止使用，推测与氯霉素同类的药物氟苯尼考对分离菌株具有耐药性，如果使用这些药物治疗，会导致治疗失败；分离菌株对青霉素、阿莫西林、氨苄西林、强力霉素、恩诺沙星、环丙沙星均敏感。根据药敏试验结果，我们指导养殖户，强力霉素拌料饲喂5～7 d，发病猪只使用大剂量青霉素肌肉注射，很快控制病情。

本次试验中，选择TSA琼脂平板（含终浓度为5%的新生牛血清、10μg/mL NAD）作为分离病原菌的培养基，是因为该培养基适合多种猪病原细菌的生长，例如副猪嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、猪丹毒杆菌、巴氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌等。试验中均未分离到上述病原菌，进一步确诊本次发病是由猪链球菌引起，无其他病原菌混合感染。