商洛黄芩叶部黄芩苷的提取及抑菌效果试验

张晓虎，白亚男，殷佳琦，肖秦箭

(商洛学院 生物医药与食品工程学院，陕西 商洛 726000)

引言

多年生中草药黄芩，以根入药，是中国产地分布较为广泛的一种传统大宗植物药材[1～3]。陕西省商洛地区适宜黄芩生长，所产黄芩产量大、品质佳、市场前景良好，被誉为“五大商药”之一[4]。目前已从黄芩中分离和鉴别出黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、木蝴蝶素A、二氢木蝴蝶素A、千层纸素A和白杨素等超过120种的黄酮糖苷及苷类化合物[5]。

黄芩苷系黄酮衍生物，在黄芩中以羧酸盐存在，连有葡萄糖醛酸结构，水解后产生黄芩素和葡萄糖醛酸，在常见脂溶性溶剂中均具有一定的溶解度，但只能微溶于热水。黄芩苷的提取有水提酸沉提取法、碱醇胶胨提取法、超声提取法、超滤提取法、双水相分配提取法、超高压提取法、微波预处理提取法等多种方法[6,7]；其精制方法也有很多，如重结晶法、沉淀分离法、高速逆流分离法、大孔树脂分离法等[8]。已有研究表明，黄芩苷除常用解毒作用外，还具有清除氧自由基、抗氧化、免疫功能调节、抗菌及抗病毒、抗肿瘤、脑组织保护和保肝等功效；此外，黄芩苷具有广泛的抗菌谱，可以抑制白念珠菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、溶血性链球菌、大肠埃希氏菌和沙门氏菌等[9-12]。

中草药具有的长期使用不容易引起抗药性、作用温和等独有特性已为公众所熟知，如今黄芩中的黄酮类物质开发用作高效、安全的天然抗氧化剂、防腐剂在食品科学领域已引起人们的关注[13]。黄芩的非药用部位如黄芩叶，大多被种植者所丢弃，造成资源浪费。笔者以商洛山区丰富的黄芩叶为原材料，采用操作较为繁琐但提取得率较高的乙醇回流法提取其中的黄芩苷；并以大肠埃希氏菌作为革兰氏阴性菌的代表，以金黄色葡萄球菌作为革兰氏阳性菌的代表，采用比浊法研究黄芩苷的抑菌作用效果，以期提高当地黄芩叶的开发利用价值，为黄芩苷在食品防腐保鲜中的应用提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂 主要有:

材料：两年生黄芩叶(2017年10月采摘于陕西省商洛市商州区黄芩种植基地)。

试剂：黄芩苷标准品；活性炭；甲醇，95%乙醇，均为分析纯；盐酸，氢氧化钠等。

菌种：大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌。

1.1.2 仪器设备 研究所用主要仪器设备见表1。

1.2 研究方法

1.2.1 原料预处理 鲜黄芩叶105℃杀青30 min， 40℃恒温鼓风烘干48h至恒重，粉碎后40目筛过筛处理，备用。

表1 主要仪器设备

1.2.2 黄芩苷标准曲线的制备 黄芩苷标准溶液：准确称取黄芩苷标准品0.5 mg，置于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，充分摇匀即得5μg·mL-1黄芩苷标准溶液。

标准曲线：分别吸取黄芩苷标准溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL至6个10 mL的容量瓶中，以甲醇定容，摇匀即得0.5、1、2、3、4、5 μg·mL-1黄芩苷标准溶液。用甲醇溶液为空白对照，在波长278 nm处用紫外可见分光光度计测定各黄芩苷标准溶液的吸光度值。以吸光度为纵坐标(Y)，以黄芩苷标准溶液浓度为横坐标(X)，用Excel绘制黄芩苷标准曲线见图1，得线性回归方程Y=59.778X+0.0019，R2=0.9949。

图1黄芩苷标准曲线

1.2.3 黄芩叶黄芩苷的提取 主要有:

(1)准确称取黄芩叶样品2 g至试管中，加入70%的乙醇作为提取溶剂。

(2)静置过夜后置入回流烧瓶，回流提取2次，每次60 min，抽滤并合并两次提取的滤液。浓缩回收提取溶剂乙醇。

(3)浓缩液水浴加热至50℃，用盐酸将pH调节至1～2，保温30 min后，转移至50 mL离心管中，以转速4 000 r·min-1离心15 min，取沉淀。

(4)沉淀中加入10倍体积的蒸馏水进行搅拌，至完全溶解，用20%的NaOH调节pH至中性，转移至50 mL离心管中，在4 000 r·min-1离心15 min，取上清液。

(5)上清液水浴加热至40℃后，加入等体积的体积分数为70%的乙醇，并不断搅拌，转移至50 mL离心管中，以转速4 000 r·min-1离心15 min，取上清液。

(6)用盐酸将上清液pH调节至1～2，在80℃下保温30 min，静置后，转移至50 mL离心管中，在4 000 r·min-1离心15 min，取沉淀，在60℃烘干至恒重，即为黄芩苷粗品[14]。

1.2.4 黄芩苷得率的计算 准确称取40 mg黄芩苷粗品至10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀后精确移取1 mL样品液于10 mL容量瓶中，再以甲醇定容并充分摇匀，在278 nm波长处，测其吸光度。黄芩苷含量依1.2.2线性回归方程计算，见公式(1)；黄芩苷得率计算，见公式(2)。

(1)

(2)

式中：X-黄芩苷含量，%；Y-黄芩苷得率，%；C-样品溶液质量浓度，mg·mL-1；V-样品液体积，mL；N-样品液测试前稀释倍数；M1-吸光度测定所用黄芩苷质量，mg；M2-黄芩苷粗品质量，mg；M0-黄芩叶样品质量，mg。

1.2.5 单因素实验 按1.2.3提取工艺及1.2.4计算方法，分别考察料液比(1∶4、1∶8、1∶12、1∶16、1∶20)、乙醇体积分数(60%、65%、70%、75%、80%)、提取温度(70、75、80、85、90℃)、提取时间(30、60、90、120、150 min)等4个因素对对黄芩苷得率的影响。

1.2.6 正交试验设计 基于1.2.5实验，选取影响黄芩苷得率较大的3个因素，每个因素选取较优的3个水平，以L9(33)设计正交试验，以获得优化提取的有关工艺参数。

1.2.7 抑菌效果试验 以比浊法评价抑菌效果，该方法对菌浊液稀释或浓缩，使其吸光度值在0.2～1的范围内，此范围内的所测吸光度值与浓度之间呈显著相关[15]。包括3个阶段：

(1)准备阶段。活化液制备：制备两份活化液，称取葡萄糖每份10 g，用蒸馏水配制成10%的溶液，灭菌备用。

菌浊液制备：分别将2种供试菌接种至活化液内，置于振荡培养箱内摇床120 r·min-1，30℃下培养活化1 h。

液体培养基制备：取18个锥形瓶，编号1～18，分别称取牛肉膏2.0 g、蛋白胨10.0 g、氯化钠5.0 g、水1 000 mL搅拌加热至全部溶解，分别倒入18个锥形瓶中，每个60 mL，在121℃高压灭菌20 min，放入4℃冰箱中备用。黄芩苷纯化：采用重结晶法进行黄芩苷的纯化，即准确称取提取所得黄芩苷粗品质量后，以10倍的水量加入，用20%的NaOH将pH调节至6.5～7，不断搅拌直至全部的黄芩苷溶解，加入适量的活性炭充分混匀，在80℃条件下水浴保温30 min，抽滤以使活性炭除去，滤液用HCl将pH调节至1～2，添加等体积的95%的乙醇，搅拌至均匀，置于50℃水浴锅中保温反应30 min，静置并过夜使沉淀自然析出，经过抽滤，以少量95%的乙醇冲洗沉淀后，将沉淀刮取下来，在60℃下烘干，即得黄芩苷纯品[16]。

经纯化处理后的黄芩苷溶液的配制：取纯化的黄芩苷0.5 g，用甲醇溶解配制成浓度为1、2、4、6、8、10 mg·mL-1的黄芩苷溶液，备用。

(2)接种与培养阶段。在无菌操作台向1～6号锥形瓶内各加入1 mL金黄色葡萄球菌的菌浊液，并按次序分别加入6个浓度的黄芩苷溶液；向7～12号锥形瓶内各加入1 mL大肠埃希氏菌的菌浊液，并按次序分别加入6个浓度的黄芩苷溶液；向13～18号锥形瓶内依次分别加入6个浓度的黄芩苷溶液，置摇床120 r·min-1，37℃下培养24 h。

(3)评价阶段。以在无菌的液体培养基中加入相同浓度的黄芩苷溶液作为对照，等比例稀释菌浊液组与对照组，在278 nm波长处测定吸光度。在同一稀释浓度下，若吸光度值大于对照组，则说明有菌生长，且差值越大，菌种生长越旺盛；若吸光度值小于对照组，则说明无菌生长；若吸光度值相同，则说明培养基内完全无菌种生长的黄芩苷溶液最低浓度即为黄芩苷对该菌种的最低抑制浓度。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果与分析

2.1.1 料液比 图2所示，随料液比的增大，黄芩苷得率先增大，当料液比为1∶12时，达到最大为2.01%；料液比超过1∶12后，黄芩苷得率反而减小。究其原因是料液过小且抽滤后滤液更少，使提取不够充分；料液比过大，加热时的负荷增多，使提取达到完全程度耗时增加，在有限时间内提取不完全，致使得率变小。所以，料液比1∶12为宜。

图2料液比对黄芩苷得率的影响结果

2.1.2 乙醇体积分数 图3所示，随着乙醇体积分数的增大，黄芩苷得率先增大后减小。当乙醇体积分数60%时，黄芩苷得率仅为1.12%；而70%时的黄芩苷得率达到最大为2.02%。这可能是因为乙醇低体积分数时，溶出的水溶性杂质量增加，黄芩苷得率较低；70%乙醇与黄芩苷极性相似，利于黄芩苷的溶出，黄芩苷得率最大；当乙醇体积分数继续增大时，黄芩苷得率反而逐渐下降，是由于乙醇溶液极性较小，导致黄芩苷得率下降。因此，选取乙醇体积分数70%为宜。

图3乙醇体积分数对黄芩苷得率的影响结果

2.1.3 提取温度 图4所示，随提取温度的升高，黄芩苷得率有所增加，80℃时黄芩苷在乙醇中的溶出程度最大，所以得率最高；而高于80℃时黄芩苷得率开始下降，是因为黄芩苷在高温下极不稳定，过高的温度造成黄芩苷部分分解。因此，选取80℃的提取温度为宜。

图4提取温度对黄芩苷得率的影响结果

2.1.4提取时间 图5所示，黄芩苷得率随提取时间变化趋势缓慢，总体上随时间的增加先增大后减小，当提取时间为60 min时，黄芩苷得率达到最大为2.02%；提取时间超过60 min，黄芩苷得率未升而降。这是因为黄芩中的可溶性物质如单宁、蛋白质、黏液等水溶性和醇溶性杂质伴随提取时间的增加被更多地溶解释放出来，从而使黄芩苷分子被包裹起来，导致其向溶液中的扩散受阻，以致黄芩苷得率有所下降[17]。但相对其他三个因素而言，提取温度对黄芩苷得率的影响并不显著。

图5提取时间对黄芩苷得率的影响结果

2.2 正交试验结果与分析

根据单因素实验的结果，在固定提取时间60 min的前提下，选取对黄芩苷得率影响较大的料液比(A)、乙醇体积分数(B)、提取温度(C)3个因素，每因素选取3个水平，采用L9(33)设计正交试验，正交试验设计及结果见表2。

由表2直观分析可知，B的极差较大、其次为A、再次为C，因此，对黄芩苷得率的影响因素排列为：B>A>C，即乙醇体积分数>料液比>提取温度；得到的提取黄芩苷最优工艺组合为A2B1C2，即在提取时间60 min的条件下为：料液比1∶12、乙醇体积分数70%、提取温度80℃，黄芩叶中黄芩苷得率2.03%。

表2 L9(33)正交试验设计及结果

2.3 验证实验结果与分析

在黄芩苷提取的最优工艺下进行验证实验，取3次平行实验的平均值，验证该条件下黄芩苷得率的稳定性。即准确称取黄芩叶样品2g，用体积分数为70%的乙醇溶液浸泡过夜，料液比为1∶12，在80℃下回流提取2次，每次60 min，按1.2.3的方法进行黄芩苷的提取，并按1.2.4的方法计算黄芩苷得率，结果见表3。

由表3可知，3次实验的黄芩苷得率稳定，表明采用乙醇回流法对黄芩叶中的黄芩苷进行提取的优化工艺可行。

2.4 抑菌效果试验结果与分析

黄芩叶中的黄芩苷对2种供试菌的抑菌效果试验结果见表4。

表3 黄芩苷提取工艺验证实验结果

注: 表中“+ ”表示同稀释浓度下的吸光度值>对照组；“-”表示吸光度值<对照组，即无菌生长。

由表4可知，在金黄色葡萄球菌的菌浊液添加黄芩苷溶液浓度超过4 mg·mL-1时，表现出抑菌效果；在大肠埃希氏菌的菌浊液添加黄芩苷溶液浓度超过8 mg·mL-1时，表现出抑菌效果。

3 结论与讨论

3.1 结论

研究以采集的商洛黄芩叶片为原料，设置正交试验用于探讨乙醇回流法提取黄芩苷的工艺条件，试验得到的优化提取工艺参数为：当料液比1∶12，采用体积分数70%的乙醇，在80℃下回流提取两次，每次60 min，黄芩苷得率达2.03%。

分别以革兰氏阴性菌中的大肠埃希氏菌、革兰氏阳性菌中的金黄色葡萄球菌为试验菌种，用最小抑制浓度评价黄芩苷的抑菌效果，试验表明：菌浊液中添加黄芩苷溶液浓度大于4 mg·mL-1时，对金黄色葡萄球菌表现出抑制作用；添加黄芩苷溶液浓度大于8 mg·mL-1时，对大肠埃希氏菌表现出抑制作用。

3.2 讨论

一般黄芩除药用部位其干燥根入药外，其他非药用部位大多被丢弃，且目前对黄芩叶中活性成分研究又较少，使黄芩叶资源利用不够充分。笔者对黄芩叶中的有效成分黄芩苷提取并进行抑菌效果研究，其初步成果将能够作为食品防腐保鲜的技术参考，有利于促进黄芩叶资源的综合利用。

试验得出的优化提取工艺参数，以及影响黄芩苷提取得率的因素排序为乙醇体积分数>料液比>提取温度等，与雷燕妮等人的研究结果基本一致[18]；黄芩苷对供试菌的抑菌效果与张有志等人试验结论基本一致[19]。

试验对金黄色葡萄球菌抑制作用的黄芩苷溶液浓度大于4 mg·mL-1，而孙冬梅等[20]的研究表明对金黄色葡萄球菌起抑制作用的黄芩苷浓度最低为2 mg·mL-1。这可能是由于黄芩苷的纯化过程中加入的活性炭过少，导致纯化的不完全，仍含有部分杂质，使得出的最低抑菌浓度偏高，也可能是因为选用的黄芩苷溶液浓度梯度过少，导致结果存在一定偏差。