激活蛋白1(AP-1)在豚鼠进展性近视巩膜重塑中与I型胶原的表达关系研究△

展欣 朱子诚 孙思勤 张楚

近视是目前最常见的屈光不正，在全球有很高的发病率，在东亚的年轻人中近视患病率高达80%～90%，已成为该地区致盲的主要原因，在西方国家，近视是最常见的需要治疗的疾病，成人患病率为15%～49%不等，全球范围内约1/5的近视人口因高度近视导致不可逆的视觉损失，如视网膜脱离、脉络膜新生血管、白内障、青光眼、近视性黄斑病变等[1-2]。目前对近视的研究大多认为是遗传与环境等多种因素共同作用的结果[3]，形觉剥夺动物模型的建立、分子生物学的不断发展使得人们对近视的发病机制有了进一步认识。有研究表明，转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-β1在近视眼巩膜重塑过程中发挥着重要的作用，可通过下游信号转录基因调控Ⅰ型胶原的合成与降解[4]。激活蛋白-1(activator protein 1，AP-1)是一类转录因子，在体内可调节多种成纤维细胞胶原的合成与降解，同时AP-1也是多种信号通路的下游转录因子[5]，但AP-1在巩膜中是否表达，以及与TGF-β1、Ⅰ型胶原合成与降解的关系尚未见文献报道。本研究采用豚鼠建立形觉剥夺性近视(form-deprivation myopia，FDM)模型，采用免疫组织化学染色、逆转录PCR法检测豚鼠正视眼及实验性近视眼不同时间点AP-1的动态表达变化以及Ⅰ型胶原表达变化，并分析二者的关系，进一步明确TGF-β1信号通路在近视巩膜重塑中的作用。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物选用出生7 d、体质量100～140 g 的健康新生三色豚鼠75只，雌雄不限，排除有先天性近视及其他全身疾病的豚鼠，在安徽医科大学附属省立医院实验动物中心室内12 h自然照明/12 h黑暗环境下并给予水、富含维生素的豚鼠饲料及新鲜蔬菜等饲养，室内温度为22 ℃。实验动物的使用和喂养遵循ARVO有关动物使用条款，研究方案经安徽医科大学实验动物伦理委员会审查批准。

1.1.2主要试剂及仪器抗鼠AP-1抗体(1150)(AD082529，北京博奥森生物技术有限公司)；抗鼠Ⅰ型胶原抗体(1150)(AA56131，上海拜力生物科技有限公司)；通用型二抗试剂盒(PV-6000)(K155922D，北京中杉金桥生物技术有限公司)。A型超声(AL-100，日本TOMEY公司)；YZ24带状光检影镜(苏州六六视觉科技股份有限公司)。普通PCR仪(K960，杭州晶格科学仪器有限公司)逆转录试剂盒(00287813，Thermo公司)。

1.2方法

1.2.1动物FDM模型的建立和分组随机抽取50只豚鼠，遮盖它们的左眼建立FDM模型(FDM)组(随机分为5组，每组10只)，其右眼作为自身对照组，其余25只豚鼠双眼均未做任何处理作为空白对照组(随机分为5组，每组5只)，FDM组的豚鼠佩戴头套，具体方法：采用6号半透明乳胶气球套住豚鼠头部，将右眼、鼻唇部及耳部气球剪去并暴露这些部位，左眼气球保留遮盖，用订书机将气球头套于颈部对折固定，防止眼罩滑落及旋转。空白对照组豚鼠的双眼不作任何处理。

1.2.2屈光度及眼轴长度的测量将豚鼠标记、编号，分别于遮盖前(0周)及遮盖后2周、4 周、6周和遮盖4 周去遮盖1周等不同时间段双眼结膜囊滴复方托吡卡胺滴眼液充分散瞳，在暗室内采用带状光检影验光，精确到0.01 D，将各组豚鼠双眼结膜囊滴5 g·L-1盐酸丙美卡因滴眼液表面麻醉后，A超测定双眼眼轴长度，以手动模式连续测量3次并取平均值，精确到0.01 mm，分别由省立医院眼科中心专业技术人员测量并记录。

1.2.3免疫组织化学染色检测豚鼠巩膜中AP-1和Ⅰ型胶原蛋白的表达分别于遮盖前(0周)及遮盖后2周、4 周、6周和遮盖4 周去遮盖1周采用过量麻醉处死空白对照组各5只豚鼠及FDM组各10只豚鼠，摘取双眼眼球置于冰块上，去除眼前节组织，切取以视神经为中心、直径6 mm范围内的巩膜组织，剔除视神经组织，置于40 g·L-1多聚甲醛溶液内4 ℃固定30 min，脱水后石蜡包埋，切4 μm厚切片，行苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察各组巩膜组织着色情况。取各组豚鼠巩膜石蜡切片用体积分数3%过氧化氢去离子水孵育5 min以阻断内源性过氧化物酶，PBS冲洗；滴加相应一抗，37 ℃孵育 60 min，PBS漂洗3次，每次2 min；滴加相应二抗，37 ℃孵育20 min，PBS漂洗3次，每次2 min，DAB显色。用Image Pro Plus 6.0软件图像扫描各组后极部巩膜任意8个部位，以细胞质中出现棕黄色染色为阳性反应，AP-1和Ⅰ型胶原蛋白的相对表达量用平均吸光度(A)值表示。

1.2.4逆转录PCR法检测豚鼠巩膜中AP-1和Ⅰ型胶原的mRNA表达豚鼠处死后的巩膜组织获取方法同1.2.3。取所需巩膜组织液氮研磨，根据制造商说明将总RNA从各巩膜组织中提取。在0.2 mL PCR管(无RNase酶)中，加入总RNA，PCR仪上65 ℃加热5 min，立即冰浴3 min，逆转录为cDNA后 -80 ℃ 保存备用。以cDNA作为模板进行PCR扩增。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性 30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃延伸10 min后保存。PCR产物进行电泳，凝胶成像系统观察结果并进行拍照，为了确保准确性，所有实验进行了至少3次。实验中引物的核苷酸序列，β-actin：上游引物：5’-GCTCTATCCTGGCCTCACTC-3’、下游引物：5’-GGGTGAGGGACTTCCTGTAA-3’；AP-1：上游引物：5’-AACTCATGCTAACGCAGCAG-3’、下游引物：5’- GTCAATGCTGAACAGTCCGT-3’；Ⅰ型胶原：上游引物：5’-ACAAGCGATTACACACCCAA-3’、下游引物：5’- TTAGTTTCCTGCCTCTGCCT-3’。

1.3统计学分析采用SPSS 19.0统计学软件进行统计分析。本研究中测量指标的数据资料呈正态分布，采用均数±标准差表示。FDM组与空白对照组的比较采用两因素方差分析，FDM组与自身对照组之间的比较均采用配对t检验。采用Pearson线性相关分析评估豚鼠巩膜组织中AP-1与Ⅰ型胶原蛋白及其mRNA表达量之间的关系，并对相关系数进行假设检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1各组豚鼠屈光度及眼轴长度的比较遮盖前各组豚鼠的双眼呈远视状态，眼轴较短，FDM组遮盖眼与自身对照眼相比，遮盖前的屈光度与眼轴长度无明显变化，差异均无统计学意义(均为P>0.05)。随着遮盖时间的不断延长，空白对照组远视度数逐渐减低，眼轴长度略有增长。FDM组的屈光状态逐渐由远视变成近视，且近视屈光度数逐渐增加，眼轴逐渐延长。FDM组遮盖后的不同时间点屈光度及眼轴长度与空白对照组、自身对照组相比较，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。见表1。

表1 三组豚鼠眼球在不同时间点的近视屈光度及眼轴长度

2.2巩膜中AP-1和Ⅰ型胶原的蛋白表达各组巩膜组织均有AP-1和Ⅰ型胶原蛋白阳性表达，可见棕黄色染色(图1和图2)。FDM组随着遮盖时间的不断延长，AP-1和Ⅰ型胶原的蛋白表达量均逐渐减少，且在遮盖4周去遮盖1周时，AP-1和Ⅰ型胶原的蛋白表达量与遮盖4周相比有所上调，但仍低于遮盖2周的表达量。遮盖前FDM组的AP-1和Ⅰ型胶原蛋白表达相比于自身对照组，差异均无统计学意义(均为P>0.05)。FDM组中各遮盖后不同时间点的蛋白表达量与空白对照组、自身对照组比较差异均有统计学意义(均为P<0.05)。

图1 免疫组织化学检测各组豚鼠巩膜中AP-1的蛋白表达(黑色箭头指示棕黄色染色)。A：空白对照组中可见AP-1的蛋白表达；B：自身对照组巩膜中可见AP-1的表达；C：FDM组中遮盖2周时的AP-1蛋白表达，较其他2组表达减弱；D：FDM组中遮盖4周时的AP-1蛋白表达；E：FDM组中遮盖4周去遮盖1周时的AP-1蛋白表达；F：FDM组中遮盖6周时的AP-1蛋白表达

2.3巩膜中AP-1和Ⅰ型胶原的mRNA表达豚鼠巩膜组织中均有AP-1和Ⅰ型胶原的mRNA阳性表达(图3、图4)，随着豚鼠遮盖时间的不断延长，FDM组中AP-1和Ⅰ型胶原的mRNA表达均呈逐渐下降的趋势。在遮盖4周去遮盖1周时，AP-1和Ⅰ型胶原的mRNA表达量与遮盖4周相比有所增加，但仍低于遮盖2周的表达量。遮盖前FDM组和自身对照组之间的AP-1和Ⅰ型胶原mRNA表达差异均无统计学意义(均为P>0.05)。FDM组中各遮盖后不同时间点的mRNA表达量与空白对照组、自身对照组比较差异均有统计学意义(均为P<0.05)。

2.4FDM组豚鼠巩膜中AP-1和Ⅰ型胶原蛋白及mRNA表达相关性分析FDM组巩膜组织中Ⅰ型胶原的蛋白表达量与AP-1的蛋白表达量呈高度正相关(r=0.992，P<0.05)，Ⅰ型胶原的mRNA表达量与AP-1的mRNA表达量也呈高度正相关(r=0.965，P<0.05)，二者变化趋势基本一致。

图2 免疫组化检测各组豚鼠巩膜中Ⅰ型胶原的蛋白表达(黑色箭头指示棕黄色染色)。A：空白对照组中可见Ⅰ型胶原的蛋白表达；B：自身对照组巩膜中可见Ⅰ型胶原的蛋白表达；C：FDM组中遮盖2周时的Ⅰ型胶原蛋白表达，较其他2组表达量减少；D：FDM组中遮盖4周时的Ⅰ型胶原蛋白表达；E：FDM组中遮盖4周去遮盖时的Ⅰ型胶原蛋白表达；F：FDM组中遮盖6周时的Ⅰ型胶原蛋白表达

图3 逆转录PCR法检测各组巩膜组织中AP-1 mRNA的表达。M：标准蛋白分子量；1：空白对照组；2：遮盖前(0周)；3：遮盖2周；4：遮盖4周；5：遮盖4周去遮盖1周；6：遮盖6周

图4 逆转录PCR法检测各组巩膜组织中Ⅰ型胶原mRNA的表达。M：标准蛋白分子量；1：空白对照组；2：遮盖前(0周)；3：遮盖2周；4：遮盖4周；5：遮盖4周去遮盖1周；6：遮盖6周

3 讨论

已有研究指出，近视可能是局部视网膜信息调控的巩膜主动重塑的结果，即外界环境刺激视网膜，启动视网膜、脉络膜信号转导系统，产生的信号调控巩膜重塑，引起巩膜胶原合成减少、降解增加，导致巩膜进行性变薄，眼轴增长，最终加重视力下降及导致近视的发生[6-7]。目前对近视巩膜重塑的研究多认为是巩膜细胞外基质重塑的结果，胶原是巩膜细胞外基质的主要成分，由巩膜成纤维细胞分泌，约占巩膜总干重的90%，胶原纤维主要有Ⅰ、Ⅲ及Ⅳ型，以Ⅰ型胶原纤维为主，在近视巩膜重塑中胶原的表达都是下降的，以Ⅰ型胶原纤维表达的减少最为显著[8-9]。已有研究表明，TGF-β1在近视眼巩膜重塑过程中发挥着重要的作用，可通过下游信号转录基因调控Ⅰ型胶原的合成与降解[10]，但其具体调控机制目前尚未明确。在近视发展的过程中，最主要的形态变化是眼轴的过度延长[11]。本研究结果显示，随着遮盖时间的不断延长，FDM组的屈光状态逐渐由远视变成近视，近视屈光度数明显加深，眼轴长度明显延长，证实了FDM的形成主要是眼轴的异常增长，同时也说明本实验成功构建了FDM动物模型。

已有多种研究表明，TGF-β1是巩膜重塑中重要的转录因子，TGF-β1基因所编码的多肽在许多细胞的增殖、分化、凋亡方面发挥重要的调控作用[12]，TGF-β1在巩膜组织的表达可以促进巩膜成纤维细胞分泌胶原纤维[13]。在近视巩膜重塑过程中，TGF-β1和Ⅰ型胶原的表达都是下降的，且两者之间存在一定的正相关性[14]。本研究结果显示，在免疫组织化学染色法和逆转录PCR法检测中，随遮盖时间的延长，Ⅰ型胶原的蛋白及其mRNA表达均呈逐渐下降的趋势，且在遮盖4周去遮盖1周时，Ⅰ型胶原的蛋白表达和mRNA表达量与遮盖4周相比均有所增加，表明Ⅰ型胶原的蛋白表达及其mRNA表达量下降与遮盖时间变化一致，随着遮盖时间的延长和近视度数的增加，Ⅰ型胶原的表达是逐渐下降的。

AP-1是一类早期基因编码的核转录因子，通常是由c-Jun 和c-Fos组成的异源二聚体，参与生长控制、细胞凋亡及免疫调节等多种功能[15]。Guo等[16]研究发现TGF-β1诱导大鼠肾小球膜细胞 PAI-1表达是由核转录因子AP-1介导的，Ye等[17]在评估全反式维甲酸对大鼠 HSC的影响研究中发现，减少维甲酸或加入外源性反式维甲酸后在使 AP-1 表达增高的同时，能促进 TGF-β1表达。在以往的一些研究中已经证实AP-1是TGF-β1的下游信号转录基因，且与Ⅰ型胶原蛋白的合成及降解存在一定关系[18-19]，但AP-1在巩膜重塑中的表达及作用尚未见文献报道。本研究结果显示，遮盖前3组豚鼠的巩膜组织中均有AP-1的蛋白和mRNA的表达，在免疫组织化学染色法和逆转录PCR法检测中，随着遮盖时间的不断延长，AP-1的蛋白和mRNA表达呈逐渐下降的趋势，在遮盖4周去遮盖1周时，AP-1的蛋白表达和mRNA表达量与遮盖4周相比均有所增加，表明 AP-1 的蛋白表达和mRNA表达量下降与遮盖时间变化也是一致的，随着遮盖时间的延长和近视度数的加深，AP-1的蛋白表达也是逐渐下降的。且Ⅰ型胶原的蛋白表达与AP-1的蛋白表达呈高度正相关，Ⅰ型胶原的mRNA表达与AP-1的mRNA表达也呈高度正相关，这说明Ⅰ型胶原和AP-1的动态表达变化趋势一致。进而表明TGF-β1、Ⅰ型胶原和AP-1在近视巩膜重塑过程中可能存在一定的关系，它们随着近视度数的不断加深，在巩膜中的表达都逐渐下降。

总之，本研究表明，AP-1在豚鼠FDM眼巩膜组织中表达，在FDM组眼巩膜组织中随着遮盖时间的延长，AP-1和Ⅰ型胶原及mRNA表达量均逐渐下调，且二者的动态变化趋势一致，由此推测AP-1与Ⅰ型胶原在近视巩膜重塑过程中可能存在一定的关系，具体关系及作用机制还有待进一步研究，这为近视的防治和治疗提供了新的思路。

致谢：感谢张婧婧等专业技术人员提供测量眼轴及验光的数据！