抑制JAK/STAT信号通路对糖尿病早期大鼠视网膜Müller细胞的保护作用及对谷氨酸转运蛋白表达的影响△
2019-02-25冯闯左中夫刘文强刘学政
冯闯 左中夫 刘文强 刘学政
糖尿病状态下视网膜Müller细胞受损会引起谷氨酸含量异常增加,从而对视网膜造成毒性反应[1]。而谷氨酸转运蛋白(glutamate transporter,GLAST)为Müller细胞内的谷氨酸转运体,可对突触间隙内过多的谷氨酸给予清除,从而大大减轻其兴奋毒性[2]。研究发现,糖尿病早期视网膜GLAST表达明显下降,进而导致视网膜谷氨酸含量增加[3]。因此,在糖尿病早期降低谷氨酸含量及上调GLAST的表达对保护Müller细胞尤为重要。JAK/STAT通路与糖尿病关系密切,抑制该通路可下调血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达[4],但对糖尿病时视网膜GLAST表达及Müller细胞的影响尚不明确。因此,本研究探讨JAK/STAT通路对糖尿病状态下Müller细胞的保护作用及对GLAST表达的影响,为其对糖尿病的临床治疗提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1动物分组及模型制备雄性SD大鼠30只,体质量180~220 g [购自锦州医科大学,SCXK(辽)2014-16],将动物随机分成对照组、糖尿病组、AG490组,每组各10只。后两组采用单次腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ;美国Sigma公司) (50 mg·kg-1),72 h后检测尾静脉血糖,将血糖>16.7 mmol·L-1大鼠作为糖尿病模型。模型诱导成功后参考文献[5],AG490组给予AG490(JAK2的特异性抑制剂) 10 μL (17 mmol·L-1)玻璃体内注射给药 (双侧眼球均给药),每周1次,共4次。对照组、糖尿病组注射等剂量PBS缓冲液。1个月后进行各项指标检测。
1.1.2试剂及仪器STZ、AG490、GLAST抗体、β-actin(英国Abcam公司);谷氨酸含量检测试剂盒、免疫荧光及Western blot二抗(北京碧云天公司);血糖仪(美国强生公司);荧光倒置显微镜(日本Olympus公司);冰冻切片机(德国SLEE公司);水平电泳仪(美国BIO-RAD公司)。
1.2方法
1.2.1样本制备注药1个月后,每组取4只大鼠,40 g·L-1多聚甲醛灌注取出眼球4 ℃保存,用于免疫荧光及免疫组织化学染色。每组另取4只大鼠深度麻醉,取视网膜于2.5 mL EP管中,裂解,冰上剪碎,4 ℃离心25 min后取上清,-20 ℃保存用于Western blot检测。另外每组取2只大鼠按试剂盒操作说明用于检测谷氨酸含量。
1.2.2视网膜谷氨酸含量检测在解剖显微镜下取大鼠视网膜制备视网膜匀浆,将其与无水乙醇按16体积比混合,5000 r·min-1离心15 min,抽取上清后每700 μL加入100 μL双蒸水及50 μL衍生化试剂孵育20 min,再加入250 μL样品稀释液,取20 μL进样。利用高效液相色谱分析软件 system Gold对峰面积积分,以谷氨酸对照品对峰面积校正曲线,通过外标法计算各样品中视网膜谷氨酸含量。
1.2.3免疫荧光检测大鼠视网膜GLAST表达将眼球取出用300 g·L-1蔗糖脱水,用包埋剂包埋眼球,冰冻切片机切片,厚度为10 μm。载玻片于PBS中洗涤3次,每次3 min;体积分数3%山羊血清+体积分数0.3% Triton-100室温孵育1 h;不洗,滴加兔抗大鼠GLAST (1500),4 ℃过夜;PBS洗涤4次,每次3 min;滴加二抗,室温1 h;PBS洗涤4次,每次3 min;封片后荧光显微镜下观察。
1.2.4免疫组织化学检测大鼠视网膜p-JAK2表达眼球包埋切片方法同上,载玻片于PBS中洗涤3次,每次3 min;体积分数3%H2O2室温10 min,PBS洗涤3次,每次3 min;体积分数3%山羊血清室温孵育30 min;不洗,滴加兔抗大鼠p-JAK2 (1300),4 ℃过夜;PBS洗涤3次,每次3 min;滴加二抗,室温15 min;PBS洗涤3次,每次3 min;滴加SABC试剂,室温15 min;PBS洗涤3次,每次3 min;DAB显色,复染、脱水、透明封片后荧光显微镜拍照,并应用Image J软件分析p-JAK2表达阳性率。
1.2.5Westernblot检测大鼠视网膜GLAST、p-JAK2、p-STAT3相对表达量BCA法测定蛋白浓度,确定电泳时加入15 μL样品;电泳、转膜后10 g·L-1BSA室温封闭2 h;加入一抗(兔抗大鼠GLAST,15000;兔抗大鼠p-JAK2,110 000;兔抗大鼠p-STAT3,18000),4 ℃孵育过夜;TBST洗涤4次,每次5 min;加入二抗室温2 h,孵育后TBST洗涤4次,每次5 min;ECL显影,Image J软件分析灰度值。
1.3统计学方法统计分析采用SPSS 20.0统计软件进行单因素方差分析、LSD检验,所有数值采用均数±标准差表示。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1视网膜谷氨酸含量检测结果三组视网膜谷氨酸含量比较差异有统计学意义(F=814.00,P<0.01);同对照组比较,糖尿病组谷氨酸含量明显升高(P<0.01);同糖尿病组比较,AG490组谷氨酸含量明显下降(P<0.01)。见表1。
2.2免疫荧光检测结果将对照组GLAST蛋白免疫荧光强度设定为100.00%,荧光强度分析结果显示:三组之间比较,总体差异有统计学意义(F=4806.65,P<0.01);同对照组比较,糖尿病组GLAST荧光强度明显降低(P<0.01);同糖尿病组比较,AG490组GLAST荧光强度明显升高(P<0.01)。见表1、图1。
2.3免疫组织化学检测结果p-JAK2表达阳性率三组之间比较,差异有统计学意义(F=3139.09,P<0.01)。同对照组比较,糖尿病组p-JAK2表达阳性率明显增加(P<0.01);同糖尿病组相比较,AG490组中p-JAK2表达阳性率明显下降(P<0.01)。见表1、图2。
图1 免疫荧光检测各组大鼠视网膜GLAST的荧光强度(标尺:50 μm)。A:对照组;B:糖尿病组;C:AG490组
图2 免疫组织化学检测各组大鼠视网膜p-JAK2表达阳性率(标尺:50 μm)。A:对照组;B:糖尿病组;C:AG490组
表1 各组大鼠谷氨酸含量、GLAST及p-JAK2表达
注:与对照组相比,aP<0.01;与糖尿病组相比,bP<0.01
2.4Westernblot检测结果GLAST蛋白相对表达量三组比较,差异有统计学意义(F=3405.05,P<0.01)。同对照组比较,糖尿病组GLAST蛋白表达明显下降(P<0.01);同糖尿病组比较,AG490组GLAST蛋白表达明显增加(P<0.01)。p-JAK2蛋白相对表达量三组比较,差异有统计学意义(F=1607.69,P<0.01)。同对照组比较,糖尿病组p-JAK2蛋白表达明显增加(P<0.01),而同糖尿病组比较,AG490组p-JAK2蛋白表达明显下降(P<0.01)。p-STAT3蛋白相对表达量三组比较,差异有统计学意义(F=2466.26,P<0.01)。同对照组比较,糖尿病组p-STAT3蛋白表达明显增加(P<0.01),而同糖尿病组比较,AG490组p-JAK2蛋白表达明显下降(P<0.01)。见表2、图3。
表2 各组大鼠视网膜蛋白相对表达量比较
注:与对照组相比,aP<0.01;与糖尿病组相比,bP<0.01
图3 Western blot检测GLAST、p-JAK2、p-STAT3蛋白相对表达量。A:对照组;B:糖尿病组;C:AG490组
3 讨论
糖尿病时视网膜损伤为糖尿病患者最常见眼部并发症,其发病机制复杂[6],尽管微血管病变是视网膜损伤不可或缺的一部分,但近年来研究发现,神经病变亦参与视网膜损伤的发病机制,且病理改变发生于血管病变之前[7]。Müller细胞可将过多的谷氨酸转化为无毒的谷氨酰胺,对维持视网膜正常功能尤为重要[8]。因此,保护受损伤的Müller细胞尤为重要[9]。GLAST为Müller细胞谷氨酸转运体,可对视网膜突触间隙内过多谷氨酸给予清除,大大减轻其兴奋毒性[2]。糖尿病状态下,视网膜中谷氨酸堆积对视网膜能产生神经毒性。本研究显示,糖尿病状态下GLAST表达明显下降,说明Müller细胞已受损,清除谷氨酸的功能降低,从而导致其浓度增加,加重视网膜的损伤。给予AG490后,GLAST表达明显增加,谷氨酸含量下降。该结果提示,AG490可能通过上调糖尿病状态下视网膜GLAST的表达进而提高Müller细胞清除谷氨酸的能力。
JAK/STAT通路可将细胞膜感受信号直接传递至核内,启动基因转录[10],而JAK2和 STAT3 作为该通路的重要组成部分,多种细胞因子可诱导 JAK2 活化,进而激活下游STAT3表达,最终导致细胞行为和功能的改变。JAK/STAT信号通路与糖尿病关系密切[11-12],但对糖尿病状态下视网膜Müller细胞的影响不清。本研究发现,糖尿病状态下视网膜p-JAK2及p-STAT3表达明显增加,提示糖尿病对视网膜JAK/STAT通路起到激活作用。而给予AG490后,p-JAK2及p-STAT3表达均受到抑制,同时伴随GLAST表达的增加、谷氨酸含量降低,提示AG490通过抑制JAK/STAT通路对受损的Müller细胞起到调节作用。本研究结果提示,JAK/STAT通路参与了糖尿病状态下Müller细胞损伤的发生发展,抑制该通路对糖尿病视网膜损伤可以起到一定的保护作用。
综上所述,本研究发现糖尿病状态下视网膜GLAST表达明显降低,谷氨酸含量明显增加,抑制JAK/STAT通路的活化可上调视网膜GLAST表达,降低谷氨酸含量,这可能有助于减轻糖尿病状态下Müller细胞的损伤。但因糖尿病致病机制复杂,AG490的临床价值仍需深入研究。