双膦酸盐类药物对骨肉瘤治疗作用的研究进展

李昌全，许 彪

(昆明医科大学附属口腔医院口腔颌面外科，昆明 650031)

双膦酸盐类药物是化学治疗性抗吸收化合物，以多种方式介导骨细胞的形态和活性，通过破骨细胞重塑来减轻骨吸收。目前双膦酸盐类药物主要用于治疗骨质流失过多的病症，如肿瘤骨转移、骨质疏松症、恶性肿瘤相关的高钙血症和佩吉特病。骨是实体瘤患者最常见的转移部位。双膦酸盐是一种治疗和预防骨骼相关事件和保持住院患者生活质量的有效药物。唑来膦酸是最有效的破骨细胞抑制剂，可用于治疗骨转移[1-2]。骨肉瘤是原发性骨癌最常见的组织学形式，约占所有原发性骨癌的20%[3-4]。骨肉瘤是儿童和青少年中最常见的原发性骨恶性肿瘤，占该人群原发性骨骼恶性肿瘤的一半以上[5]，骨肉瘤由类骨质或未成熟骨产生[6]。骨肉瘤以恶性程度高、生长迅速、早期转移和预后不佳为主要特点，早期诊断困难，病死率和致残率高[7]。原发性骨肿瘤细胞能够破坏形成骨或软骨组织，同时在骨组织中可以改变破骨细胞和成骨细胞形态，从而促进骨肉瘤形成。在原发性骨肿瘤转移期间，破骨细胞、骨基质细胞、成骨细胞和癌细胞之间可能存在恶性循环。实际上，肿瘤细胞通过分泌破骨细胞活化因子来修饰骨组织微环境，如细胞因子(白细胞介素1、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α)、激素(甲状旁腺素相关蛋白)和成骨细胞因子(如骨形态发生蛋白、胰岛素样生长因子或Wnts)，其诱导成骨细胞和破骨细胞功能之间出现不平衡。受干扰的骨细胞直接将可溶因子或释放因子分泌到细胞外基质中，刺激肿瘤生长[8-9]。现就双膦酸盐类药物对骨肉瘤治疗作用的研究进展进行综述，为临床上更好地治疗颌骨骨肉瘤提供理论指导和依据。

1 双膦酸盐类药物

1.1双膦酸盐 双膦酸盐是一种人工合成的内源性焦磷酸盐类似物[10-11]，其分子递送到骨骼增加的部位，可以增加骨形成[12]，已在临床上广泛应用，通常用于治疗破骨细胞介导的骨疾病，包括骨质疏松症、Paget病、恶性肿瘤相关的高钙血症、骨转移和与多发性骨髓瘤有关的骨病[13-14]。双膦酸盐是一类强有力的骨吸收抑制剂[15]，近年来已成功用于骨骼并发症、与骨质增生有关的骨质恶性骨疾病的治疗以及碎屑性骨吸收，并已成为治疗骨转移的主要治疗方法。双膦酸盐对骨矿物质有很高的亲和力，并能够干扰破骨细胞功能和抑制骨吸收[8,16]。双膦酸盐抑制骨降解和再吸收，降低骨更新率，其与破骨细胞数量的减少和剩余破骨细胞活性的抑制相关。破骨细胞活化是发生骨转移的基本步骤。释放疼痛化学介质是疼痛的重要机制，如通过释放激肽、P物质和前列腺素刺激骨膜内感觉神经末梢。使用双膦酸盐可以减轻疼痛[12]。

双膦酸盐具有与天然焦磷酸盐类似的结构，并可分为含氮和不含氮的双膦酸盐。含氮双膦酸盐包括阿仑膦酸盐、利塞膦酸盐、伊班膦酸盐、帕米膦酸盐和唑来膦酸。不含氮的双膦酸盐包括依替膦酸盐、氯膦酸盐和替鲁膦酸盐。所有双膦酸盐通过附着于骨上的羟基磷灰石结合位点来抑制骨吸收，特别是在具有活性再吸收的区域，由于骨组织被破骨细胞吸收，嵌入骨中的双膦酸盐被释放并降低破骨细胞骨吸收的能力[8,16]。含氮双膦酸盐通过抑制法尼基焦磷酸合成酶，促进破骨细胞与骨的附着。破骨细胞从骨表面脱离，从而抑制骨吸收。另一方面，不含氮的双膦酸盐在细胞内代谢成替代腺苷三磷酸的末端焦磷酸部分的底物，形成在细胞的能量代谢中与腺苷三磷酸竞争的非功能性分子。这一过程引发破骨细胞凋亡，导致骨破坏的减少。含氮双膦酸盐是较不含氮的双膦酸盐更有效的抗再吸收剂。此外，不含氮的双膦酸盐具有较高抑制骨矿化的潜力，可以引起骨软化。因此，不含氮的双膦酸盐不再被广泛使用。

双膦酸盐的不良反应包括急性期反应(10%～30%)，伴有肌痛、关节痛、头痛和流感样症状的短暂性发热、短暂性低钙血症(18%)，低磷血症(10%)，肌肉骨骼疼痛(≤6%)，胀气(≤4%)，头痛和胃食管反流病(3%)，便秘或腹泻(≤3%)，腹痛(2%～7%)，食管溃疡(2%)，反流(1%～5%)，腹胀、胃溃疡、胃炎和肌肉痉挛(≤1%)[9]。

1.2唑来膦酸 唑来膦酸是最新一代的双膦酸盐，是破骨细胞介导的骨吸收抑制剂，可有效治疗各种实体瘤患者的骨转移，也是双膦酸盐家族中最有效的成员，用于减少患有骨转移的各种恶性肿瘤患者的疼痛。在治疗骨肿瘤中，比双膦酸盐更有效[9,17]。唑来膦酸是一种内源性焦磷酸的第三代含氮双膦酸盐类似物，与含钙的羟基磷灰石骨矿物质结合紧密。唑来膦酸的血浆半衰期<24 h，但双膦酸盐在骨骼中稳定，骨骼半衰期超过300 d[18]，作为预防骨质疏松症和某些类型骨转移相关癌症的骨骼并发症标准治疗[19-20]。唑来膦酸除有抗肿瘤转移的潜能外，还具有直接或间接的免疫抗肿瘤作用，能阻断肿瘤细胞黏附，使肿瘤细胞更容易受到化疗的细胞毒作用，其机制包括损害迁移和侵袭、调节免疫反应和抗血管生成作用、抑制肿瘤增殖和诱导细胞凋亡。通常唑来膦酸通过抑制法尼基焦磷酸合成酶和香叶基焦磷酸合成酶导致抑制小GTP酶(如Ras、Rho和Rac)的异戊二烯化，而法尼基焦磷酸合成酶和香叶基焦磷酸合成酶是细胞增殖、迁移和侵袭所必需的合成酶。临床前研究报道唑来膦酸可以预防体内骨肉瘤的肺转移，其抗肿瘤作用是通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡、协同对细胞毒性剂的抑制作用、抑制血管生成、减少肿瘤细胞黏附于骨骼、减少肿瘤细胞的侵袭和迁移、解体细胞骨架和激活特定细胞抗肿瘤免疫反应实现的[20]。临床证据表明,唑来膦酸可改善有骨和无骨癌症患者长期生存的临床试验转移效果[21-22]。

2 双膦酸盐类药物在骨肉瘤中的应用

2.1双膦酸盐与骨肉瘤 双膦酸盐类似物可能通过改变破骨细胞膜的通透性或改变成熟破骨细胞吸收骨的能力来影响破骨细胞前体的分化和募集[23]。双膦酸盐已被证实具有抑制破骨细胞分化，促进骨形成的作用，研究发现其可以抑制颌骨吸收。双膦酸盐类似物还被证实通过以下方式抑制骨肉瘤的生长：①双膦酸盐抑制高度恶性骨肉瘤细胞的增殖并诱导细胞凋亡。②抑制肿瘤细胞血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)-A和VEGF受体1蛋白的表达，诱导高度恶性骨肉瘤细胞凋亡。含氮双膦酸盐(双膦酸盐和阿仑膦酸盐)能够降低内皮细胞系中的VEGF受体2表达，并抑制内皮细胞增殖和迁移。此外，双膦酸盐通过甲羟戊酸途径，降低骨肉瘤细胞体外和体内侵袭性VEGF-A和VEGF受体1的表达。③通过对内皮细胞的直接抑制作用，抑制肿瘤诱导的血管生成。双膦酸盐不仅可通过抑制内皮细胞，减弱肿瘤诱导的血管生成和肿瘤生长，还可直接抑制骨肉瘤肿瘤细胞的增殖[9]。

甲氨蝶呤是一种有效的化疗药物治疗肿瘤，能干扰DNA和RNA在S期的合成，使G1～S期相发生转变，通过抑制剂-二氢叶酸还原酶，抑制或阻止细胞分裂并导致癌细胞凋亡。Yang等[24]通过体外实验研究发现，用2 000 μg/mL或更多的甲氨蝶呤-二膦酸盐缀合物处理24～96 h，MG63细胞的存活率显著降低。用偶联物处理的细胞在倒置相差显微术和荧光染色下显示凋亡，并且大多数细胞TUNEL检测结果阳性。电子显微镜观察到缀合物处理的细胞中染色质的核固缩和新月形聚集。用甲氨蝶呤双膦酸盐缀合物处理的MG63细胞流式细胞术显示出细胞凋亡呈时间和剂量依赖性增加。甲氨蝶呤-双膦酸盐缀合物在靶向抗骨肉瘤治疗中起关键作用，用高浓度缀合物处理可改变MG63细胞的形态，抑制骨肉瘤细胞MG63生长，诱导骨肉瘤细胞MG63发生细胞凋亡。

随着双膦酸盐治疗骨肉瘤的应用，双膦酸盐并发症的报道逐渐增多，自2003年有研究第1次报道双膦酸盐引起颌骨坏死[25]以来，陆续有相关并发症的报道[26-27]。

2.2唑来膦酸与骨肉瘤 唑来膦酸可以减轻骨疼痛，临床前研究表明唑来膦酸通过直接的抗增殖作用、免疫激活和抗血管生成活性来抑制骨肉瘤的发生发展，骨肉瘤的特征是产生含有局灶性钙的类骨质或未成熟的骨羟基磷灰石晶体沉积[28]。因此，唑来膦酸可能优先聚集在原发性骨肉瘤以及肺和骨转移部位。唑来膦酸抑制法尼基焦磷酸合成酶的合成，是甲羟戊酸途径中的关键酶，通过降低蛋白质异戊烯化作用抑制肿瘤生长[29]。骨吸收性破骨细胞因内化一定量的唑来膦酸功能容易受到抑制，广泛用于减轻成人骨转移性疼痛[30]。但含氮双膦酸盐可能具有对正常成骨细胞和各种肿瘤细胞(包括乳腺癌、骨髓瘤、胰腺癌和前列腺癌)的直接抗增殖和促凋亡作用[31]。唑来膦酸可减少骨肉瘤的动物模型中的原发性肿瘤生长，降低肺转移率并提高存活率[32]。唑来膦酸还可与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白发挥协同抑制作用，降低鼠和人骨肉瘤细胞系的细胞增殖并抑制骨肉瘤肿瘤生长[18,33]。

唑来膦酸直接抑制人骨肉瘤细胞增殖并诱导体外细胞凋亡[34]。其中γδT细胞识别、细菌代谢产物相关的小磷酸抗原、类异戊二烯生物合成甲羟戊酸途径均发挥关键作用[35]。唑来膦酸通过在双膦酸盐处理的细胞内累积甲羟戊酸途径中间体，使肿瘤细胞对γδT细胞的细胞毒性敏感[36]。唑来膦酸促进骨肉瘤患者外周血单个核细胞γδT细胞的增殖，增强γδT细胞对人骨肉瘤细胞的细胞毒性[37]。VEGF-A和VEGF受体1在侵袭性骨肉瘤细胞中高表达，但在克隆性相关性较弱的侵袭性细胞系中不表达[9]。骨肉瘤患者血浆中VEGF-A水平通常升高，唑来膦酸可以降低骨肉瘤中VEGF-A的表达，并降低患者体内VEGF-A的循环水平[38]。此外，有证据表明，唑来膦酸通过VEGF-A和VEGF受体信号通路抑制自分泌刺激，部分诱导侵袭性骨肉瘤细胞凋亡[9]。因此，含氮双膦酸盐对骨肉瘤和肿瘤相关内皮细胞具有多效抑制作用。

含氮双膦酸盐类似物有对抗骨癌转移的功效，表明含氮双膦酸盐类似物可降低溶骨性和成骨性疾病的发病率[39-40]。唑来膦酸和阿仑膦酸盐以浓度依赖性的方式降低侵袭性骨肉瘤细胞系(K7M3和143B)的细胞活力和增殖。双膦酸盐还通过甲羟戊酸途径调节骨肉瘤中VEGF-A和VEGF受体1表达，诱导高度恶性骨肉瘤细胞凋亡。唑来膦酸可抑制细胞增殖并在高度侵袭性的骨肉瘤细胞系中诱导细胞凋亡；唑来膦酸预处理还可抑制K7M3细胞的迁移，减缓体内骨肉瘤生长及肿瘤血管生成速度[9]。在体外研究中，唑来膦酸对骨肉瘤细胞能直接发挥抗治疗作用，显著减少骨肉瘤诱导的肺转移[41-42]。唑来膦酸通过直接抑制破骨细胞生长和抑制破骨细胞活化剂在肿瘤中的表达，减弱骨肉瘤诱导的骨质溶解[43]。唑来膦酸通过Rho A活化、黏着斑激酶抑制的Jun激酶和p38途径，阻断香叶基香叶基化，抑制骨肉瘤细胞转移，减弱骨肉瘤细胞迁移能力，抑制骨肉瘤细胞侵袭活性[44]。唑来膦酸可以通过降低CXC趋化因子受体4蛋白的表达和功能来削弱骨肉瘤的定向迁移能力[45]。唑来膦酸还可明显降低LM8细胞基质金属蛋白酶的分泌，抑制LM8细胞体外迁移、侵袭和黏附[46]。唑来膦酸通过激活胱天蛋白酶3抑制LM8细胞VEGF的表达，诱导LM8细胞发生细胞凋亡[47]。

体外实验证实唑来膦酸对骨肉瘤细胞MG63有生长抑制作用，并且存在时间、剂量依赖关系，唑来膦酸与甲氨蝶呤具有协同作用[48]。Horie等[49]研究显示，联合唑来膦酸与紫杉醇或吉西他滨在小鼠骨肉瘤细胞中显示出抗肿瘤作用。唑来膦酸联合熊果酸可通过增强氧化应激和自噬有效诱导人骨肉瘤细胞凋亡[50]。L-MTP-PE(脂质体形式的胞壁酰基三肽磷脂酰乙醇胺)联合唑来膦酸可显著抑制原发性骨肉瘤肺转移的进展[51]。曲妥珠单抗联合唑来膦酸可增强Vγ9Vδ2T细胞对骨肉瘤细胞的细胞毒性，有治疗骨肉瘤的潜力[52]。在唑来膦酸同步化疗治疗新诊断的转移性骨肉瘤的可行性和剂量研究中发现，唑来膦酸可以安全用于转移性骨肉瘤的化疗，未来的研究有望确定唑来膦酸在骨肉瘤患者中的潜在益处[5]。Curtis等[53]研究发现，唑来膦酸联合甲状旁腺激素可改善骨质结构和强度。唑来膦酸显示出在减少裂解引起的骨疼痛和改善骨微结构以及强度方面的潜力。Yamakawa等[54]研究显示，在溶瘤病毒治疗方面，唑来膦酸通过抑制抗凋亡蛋白和破骨细胞活化促进抗肿瘤、抑制肿瘤进展和预防骨质破坏的作用。体外研究发现,激光光化学疗法能提高顺铂或唑来膦酸在良性和恶性骨细胞中的细胞毒性。这可能是针对肿瘤骨疾病(如骨肉瘤)的一种新的治疗模式[55]。研究发现,阻断热激蛋白90激活和唑来膦酸协同作用，可以抑制骨肉瘤细胞增殖和转移发展，最终延缓骨肉瘤进展[56]。

但随着唑来膦酸的广泛使用，双膦酸盐相关性颌骨坏死的发病率也越来越高[57-58]。一项唑来膦酸联合化疗和手术治疗骨肉瘤的随机多中心的Ⅲ期临床试验证明,唑来膦酸不宜用于骨肉瘤患者[59]。Lamoureux等[60]研究发现，唑来膦酸通过触发热激蛋白27和凝聚素等热激蛋白的升高,提高骨肉瘤细胞存活率和增强抗药性。

3 结 语

双膦酸盐和唑来膦酸在骨肉瘤治疗中的应用不断增多，其在骨肉瘤治疗中的药理作用也得到进一步证实。双膦酸盐类似物和唑来膦酸具有抑制破骨细胞分化，促进骨形成，抑制骨吸收的作用，但是其引起的双膦酸盐相关性颌骨坏死的发病率也越来越高[61-62]，同时也出现了一些对唑来膦酸治疗骨肉瘤效果的质疑。颌骨骨肉瘤是最常见的口腔颌面部骨源性肉瘤，多见于儿童和青少年，病程进展快，可发生肺及脑的远处转移，预后较差[63]。99Tc-亚甲基二膦酸盐也是双膦酸盐类似物的一种，能直接降低破骨细胞活性，促进骨形成，对癌症原发灶也具有抑制作用[64-65]。深入研究99Tc-亚甲基二膦酸盐对颌骨骨肉瘤的治疗效果和机制将为拓展防治颌骨骨肉瘤提供新的思路和策略。