微RNA在缺血性脑卒中的作用

汪普求,谢芬高，文航华，曹 俊，张希洲

(三峡大学人民医院 宜昌市第一人民医院急诊医学科，湖北 宜昌 443000)

脑卒中是一种急性脑血管疾病，又名卒中、脑血管意外，由于脑部血管突然破裂或血管阻塞导致大脑严重缺血缺氧而引起脑组织损伤，并出现一系列临床表现，如额纹消失、口角歪斜、吐词不清、一侧肢体瘫痪、感觉异常等，包括缺血性脑卒中(ischemic stroke，IS)和出血性脑卒中(hemorrhagic stroke，HS)，其中以IS最为常见，占脑卒中总数的60%～70%,是世界范围内致死和致残的主要原因之一[1]。微RNA(microRNA，miRNA)是一类非编码单链RNA小分子，由22～24个核苷酸组成，主要存在于真核细胞中，参与真核生物转录后基因表达调控[2]。miRNA是内源性表达的RNA分子，在调控IS的病理生理过程中起重要作用。研究发现，miRNA在促进血管生成、神经形成和神经保护等方面可能具有重要作用，一些miRNA及其靶基因被认为参与神经损伤修复[3]。miRNA最初从基因组DNA中转录，而RNA聚合酶Ⅱ负责初级miRNA的转录。miRNA的生物学功能非常依赖细胞背景，故miRNA与脑卒中之间的确切联系应该只在特定的细胞环境中讨论。有研究表明，miRNA在脑缺血和相关疾病的分子过程中充当关键介质作用[4]。现对miRNA在IS的作用予以综述。

1 IS的病理生理学改变

IS的病理生理学机制较为复杂，尚未完全清楚。目前研究较为明确的机制主要是缺血性兴奋性毒性、相关的氧化应激、炎症反应和细胞凋亡。当大脑供血障碍时，脑组织出现供能及供氧障碍，脑细胞进行无氧代谢并产生大量乳酸，过多的乳酸堆积导致代谢性酸中毒，最终导致脑细胞坏死。细胞缺氧及能量和ATP生成不足，Na+，K+-ATP泵功能异常，一方面，因细胞内外离子及水平衡失调，细胞内Na+增多、水钠潴留而出现细胞水肿；另一方面，可出现兴奋性神经递质(谷氨酸)释放并激活相关受体，产生缺血性兴奋性毒性作用，最终导致脑细胞死亡[2]。线粒体是细胞产能的主要细胞器，脑缺血时，机体产生过多氧自由基，并激活促分裂原活化的蛋白激酶信号通路，进而出现线粒体功能障碍，氧化呼吸链中关键酶活性降低，氧化呼吸链中断，导致产能不足，最终出现脑细胞能量匮乏而死亡。

2 miRNA在干预IS中的作用

近几十年，脑卒中的临床诊断方法主要以CT、磁共振成像、脑血管造影、超声等影像学检查为主，其特异性和区分急性脑卒中及其相关危险因素的能力尚不清楚，诊断和判断预后的能力有限且成本较高。脑卒中溶栓治疗时间窗(6 h内)的限制使人们不断探索新的可用于早期诊断及治疗脑卒中的生物标志物。研究表明，miRNA有望成为符合要求的生物标志物[3]。目前，已经发现一些miRNA可用于IS的诊断及预后判断。

2.1miRNA与缺血性兴奋性毒性 缺血性兴奋性毒性指组织在缺血后兴奋性神经递质,如谷氨酸、N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)等产生过多，造成神经细胞死亡。IS最初脑组织损伤是由于缺血性兴奋性毒性导致的。谷氨酸是中枢神经系统中含量较高的最具代表性的兴奋性神经递质。IS早期，谷氨酸与突触后非NMDA受体结合，引起Na+通道开放，大量Na+内流，同时伴随Cl-和水内流，进而出现神经细胞肿胀、溶解，甚至变性坏死。此外，谷氨酸与NMDA受体结合，Ca2+通道开放，大量Ca2+内流，细胞内Ca2+超载，激活相应的Ca2+依赖型酶类及磷脂酶类，进而导致细胞膜性结构破坏，最终导致细胞死亡。

星形胶质细胞谷氨酸转运体1(glutamate transporter 1，GLT-1)负责大部分细胞外谷氨酸的清除，对预防大脑缺血性兴奋性毒性具有重要作用[5]。体外实验发现，抑制miR-124a表达可显著降低GLT-1表达水平，使脑组织谷氨酸水平增加，间接说明miR-124a参与脑缺血性兴奋性毒性作用调节[6]。动物实验证明，miR-29a、miR-181a在星形胶质细胞中含量较高且能调控GLT-1表达，能通过特殊的靶基因作用于一些重要的细胞生存/死亡通路，保护IS所致的神经细胞损伤[7-8]。过量的谷氨酸通过激活突触外NMDA受体亚基1/NMDA 2B亚基和代谢型谷氨酸受体1，导致钙超载和细胞死亡[9]。过量表达的miR-223减轻NMDA诱导的Ca2+内流，保护IS所致海马神经元兴奋性神经细胞死亡[10]。此外，还有一些miRNA参与缺血性兴奋性毒性的调节，如miR-125b、miR-263a、miR-194等通过减少突出间隙谷氨酸的积累、抑制离子通道的开放等减轻缺血所致的兴奋性毒性作用。

2.2miRNA与缺血性氧化应激 氧化应激参与机体许多生理病理过程，氧化应激性损伤是缺血性脑损伤和神经细胞死亡的基本机制之一。核转录因子2(nuclear transcription factor 2，Nrf2)/血红素氧合酶1(heme oxygenase 1，HO-1)是目前研究较多的信号通路，在调节机体氧化还原反应平衡方面具有重要作用，同时也是脑组织缺血/再灌注损伤细胞防御氧化应激的重要机制之一[11]。超氧化物歧化酶是一种内源性抗氧化酶，可快速有效灭活超氧阴离子，减轻组织损伤，有助于促进IS再灌注损伤的恢复。谷胱甘肽是机体内重要的小分子肽物质，具有抗氧化和清除氧自由基的作用。目前已发现多种miRNA直接或间接参与Nrf2信号通路的调节，miR-93拮抗剂通过激活Nrf2/HO-1抗氧化信号通路减轻缺血性脑组织损伤[12]。miR-210能提高超氧化物歧化酶和谷胱甘肽水平参与调节IS时的氧化应激反应，从而减轻脑组织损伤[13]。脑缺血时，环加氧酶2(cyclooxygenase 2，COX-2)可促进活性氧类的产生。正常情况下，COX-2表达量很少，脑缺血可诱导COX-2在神经细胞中的表达。已有研究发现，miR-146a能抑制COX-2在神经系统疾病中的表达[14]。动物实验表明，miR-424的过度表达能保护短暂性局灶性脑缺血/再灌注损伤，同时抑制过氧化氢诱导的氧化应激造成的细胞损伤[15]。miRNA通过改变相关酶类表达，从而起到保护或促进缺血性脑损伤作用，使miRNA可能成为潜在的用于改善IS后氧化应激的新型治疗药物。

2.3miRNA与缺血后炎症反应 炎症反应是IS病理生理过程的重要环节之一。缺血性脑损伤的炎症反应由多种细胞、炎性因子、趋化因子、活性氧类、损伤相关分子模式、自身抗体等共同参与[16]。研究表明，miR-424能抑制小胶质细胞活化，从而保护缺血性脑卒中所致的神经组织细胞损伤[17]。Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)是由小胶质细胞和星形胶质细胞表达,能激活核因子κB信号通路，进而促进促炎基因、细胞因子和黏附分子的表达。目前，已发现多种TLR，并且发现TLR4信号通路参与缺血后炎性损伤的调节。TLR4是小胶质细胞中miR-181c的直接作用靶点，可下调TRL4的表达，此外，miR-181c还可抑制核因子κB的活化以及促炎因子的产生[18]。miR-155通过上调TLR4表达同时抑制炎性介质(细胞因子信号转导抑制因子1、髓系分化初级反应基因88)表达,从而促进肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β表达[19]。还有一些miRNA参与脑缺血后炎症调控，如miR-146a、miR-106a、miR-124、miR-9和miR-219等，通过改变其表达水平调节相应的炎性因子表达，起到促进或抑制炎症反应作用。

2.4miRNA与缺血细胞凋亡 凋亡、坏死和坏疽是IS发病的3种细胞死亡类型。细胞凋亡是基因控制下细胞自主有序的死亡，有助于维持机体内环境的稳定，在某些病理情况(如卒中)可加速细胞凋亡。细胞凋亡机制复杂，涉及一系列的基因激活、表达等，其中有许多信号通路及化学途径参与，如膜蛋白受体通路(Fas/FasL)、胱天蛋白酶(caspase)途径。氧葡萄糖剥夺/再灌动物实验模型表明，Fas是miR-25作用靶点，且miR-25能抑制Fas/FasL途径活化，从而减轻脑卒中后细胞凋亡[20]。caspase-3在细胞凋亡中起不可替代的作用，其表达量增加可促进细胞凋亡。动物研究发现，miR-99a抑制cspase-3前体蛋白表达及caspase-3的活化，同时预防IS后的神经细胞凋亡[21]。miR-let-7c-5p能抑制caspase-3表达，从而减少脑缺血所致细胞凋亡[22]。B细胞淋巴瘤/白血病2(B cell lymphoma/leukemia 2，Bcl-2)基因可以抑制由多种细胞毒因素引起的细胞死亡。miR-9能特异性调控Bcl-2l11表达，从而减少细胞凋亡[23]。Bcl-2和Bcl-xL蛋白是减轻缺血后细胞凋亡和细胞死亡的关键调节因子。急性缺血性脑卒中后，miR-106b-5p表达量明显增加，并直接作用于髓细胞白血病1蛋白。髓细胞白血病1蛋白是Bcl-2家族成员之一，是DNA损伤后调控细胞凋亡关键因子[24]。组蛋白去甲基化酶10是一种抗凋亡因子，其表达受miRNA调控，急性IS时，miR-146a表达量显著下降，miR-146a能显著上调组蛋白去甲基化酶10表达，从而减少神经细胞凋亡[25]。热激蛋白(heat shock protein，HSP)A12B是HSP70家族成员之一，参与缺血后神经组织凋亡的调控[26]。有报道miR-134在IS中起重要作用，可负向调控HSPA12B诱导的细胞凋亡[27]。此外，还有一些miRNA参与缺血后脑细胞凋亡的调控，如miR-323、miR-9、miR-124、miR-497等均通过改变其表达量参与细胞卒中后脑细胞凋亡。

2.5miRNA在脑卒中的潜在治疗作用 IS发病率居高不下，且呈年轻化趋势，针对IS的治疗药物十分有限，最有效的治疗药物主要是重组组织型纤溶酶原激活剂[28]。而重组组织型纤溶酶原激活剂只适用于急性IS的溶栓制剂，治疗时间窗短，一般只用于IS发病6 h内，因此仅适用于10%的IS患者。溶栓治疗存在许多局限性和不良反应，其中主要不良反应是可增加出血风险，故需要挖掘其他可用于治疗IS的新制剂。miRNA是一种能调控机体某些潜在有毒基因表达的内源性分子，故可作为一种潜在用于治疗IS的生物制剂。miRNA参与神经保护、促进神经形成、血管生成等基因的表达，从而促进IS患者脑组织损伤修复，降低病死率，提高远期生存质量。

2.5.1神经保护作用 水通道蛋白4是中枢神经系统中重要的通道蛋白。IS发作时，水通道蛋白4表达量增加，使大量水通道开放，过多水分子进入细胞内，导致脑细胞水肿，最终出现细胞死亡。研究发现，过度表达的miR-29b能抑制水通道蛋白4的表达，从而缩小脑梗死面积，减轻脑水肿，减轻血脑屏障损伤[29]。动物实验表明，抑制miR-497的表达，使脑缺血区Bcl-2及Bcl-W蛋白表达量增加，从而减轻IS，减轻神经系统损伤，间接起到保护神经组织的作用[30]。肿瘤坏死因子作用因子3已被证实为缺血性级联信号中央调制器，包括神经元死亡、神经细胞凋亡、炎症和氧化应激[31]。有实验表明，miR-455通过抑制肿瘤坏死因子作用因子3表达，减轻大脑中动脉闭塞所致的神经元细胞缺血缺氧性的脑组织损伤[32]。此外，其他miRNA(miR-181a、miR-21、miR-347、miR-124等)通过相应的途径直接或间接参与缺血后神经保护，故这些miRNA有望成为潜在的诊断IS的生物标志物和治疗脑缺血的生物制剂。

2.5.2神经形成 神经系统功能的维持依赖结构的完整性，同时其增殖、分化、发育需多种重要物质参与，其中神经营养因子是重要小分子物质之一。血管内皮生长因子是一种促进血管生成的神经形成营养因子，IS过度表达的miR-210能上调血管内皮生长因子表达，进而诱导成年小鼠脑内神经形成[33]。miR-124a通过激活Notch信号通路促进缺血后神经形成[34]。其他一些miRNA也参与神经形成，如miR-9可促进人类神经祖细胞的增殖，miR-17-92通过糖皮质激素信号通路影响神经形成，可见，miRNA的药理调控作用可能是缺血后神经形成的潜在机制。

3 小 结

miRNA在IS的病理生理过程、诊断及潜在治疗效果等方面均发挥重要作用，使基于miRNA的新型生物制剂具有很大的应用前景。目前，miRNA的研究多停留在动物水平，如何成功将其转化为人体水平的研究仍是一大难题。针对miRNA靶向剂的研发仍面临较多困难，譬如,如何维持其在体内的稳定性、药动学、定向有效组织分布等。随着研究的不断深入，期待miRNA靶向剂能顺利生产并更好地应用于临床，挽救更多患者的生命。