微管稳定性异常与帕金森病

杨 璇 陈 峥 贾炳泉 吴春艳 王 佳 宋彬彬 陈艳清 于 佳

一、神经元中的微管

神经元的微管结构亚单位与其他类型细胞微管结构亚单位的组分基本相同，原纤维以α-微管蛋白(tubulin)和β-tubulin相互交替形式进行装配，形成了α-tubulin暴露在微管的一头，而β-tubulin在另一头的极化结构。微管的聚合由特异的核心形成位点起始，主要是中心体，被称为微管微管组织中心。在中心体内，γ-tubulin可形成一个环形结构，被称为γ-tubulin环形复合体。α-tubulin和β-tubulin二聚体结合到γ-tubulin环形复合体, 通过与γ-tubulin相互作用形成短的微管, γ-tubulin环形复合体促使微管的负端稳定，微管的正端从此生长、延伸。微管一直处于动态的解聚和组装过程中，在微管正端速率较大，在负端速率较小。近年来研究发现，神经元中微管的组装可能并不依赖于中心体。Stiess等[1]发现在微管解聚药物诺考达唑处理后，成熟的海马神经元内微管组装并以中心体为核，而是在整个细胞中随机成核组装。进一步研究发现，随着神经元的发育γ-tubulin的定位发生了改变，在未成熟神经元中γ-tubulin都分布在中心体，而在成熟神经元大量γ-tubulin存在于轴突中，提示成熟的神经元轴突中微管可直接发生组装，而不必由中心体起始。树突与轴突的微管排列也不一致：在轴突微管排列成方向一致的微管束，只以其正端朝向轴突末端；在树突则不仅有正端向树突末端的微管束，也存在负端向树突末端的微管束，在树突近胞体端，负端向树突末端的微管束约占80%，而在远端约占20%。

二、神经元中微管的功能

1.维持神经元极性：微管对于神经元极性的形成至关重要。在神经元极化的过程中，其中一个神经突起内的微管发生了重组，排列由原先的双向变为了正端朝向突起末端的单一方向，而其他突起中的微管排列方向不发生改变，从而使得神经元出现轴突和树突，神经元发生极化。改变微管的稳定性会影响神经元极性。利用紫杉醇增加微管的稳定性会导致神经元产生多个轴突样结构；而诺考达唑处理的神经元轴突生长受到抑制，轴突分支明显减少[2]。

2.作为轴突运输的轨道：在轴突内无内质网及溶酶体等细胞器存在，轴浆和轴突膜中的蛋白需要在胞体中合成后运送，而轴突内的代谢产物也需要转运至胞体进行降解，因此轴突运输对于神经元功能的维持十分重要。轴突运输主要是通过驱动蛋白(kinesin)家族和动力蛋白(dynein)家族蛋白与微管结合，以微管作为轨道进行运输。kinesin家族蛋白向微管正端移动，介导了顺向轴突运输；而dynein家族蛋白则向微管负端移动，介导了逆向轴突运输。轴突运输可分为快速轴突运输和慢速轴突运输，快速轴突运输通常转运突触囊泡以及囊泡相关蛋白，速度约为每天50～400mm；慢速轴突运输主要转运丝状骨架蛋白、神经丝、微管蛋白以及可溶性的蛋白，速度约为每天0.2～10.0mm[2]。

三、PD中微管稳定性的异常

1.PD患者细胞中微管稳定性的异常：微管蛋白的翻译后修饰种类繁多，其中研究最广泛的是乙酰化、酪氨酸化/去酪氨酸化。微管蛋白的乙酰化修饰主要发生在α-tubulin的第40 位赖氨酸残基。一般认为α-tubulin 乙酰化促进了微管的稳定性。此外，将α-tubulin的乙酰化位点K40突变为R使其失活导致kinesin与α-tubulin的结合作用显著降低，同时轴丝运动速度降低，提示α-tubulin 的乙酰化可促进Kinesin介导的轴突运输功能[3]。微管蛋白的去酪氨酸/酪氨酸化是迄今研究最多的微管蛋白翻译后修饰形式。α-tubulin 的羧基端最后一个氨基酸是酪氨酸，可在酶的催化作用下进行“去酪氨酸化/酪氨酸化”循环。tubulin去酪氨酸化可降低微管与有微管解聚作用的kinesin-13 家族蛋白的相互作用，抑制微管的解聚，提高微管的稳定性[4]。在神经元中，去酪氨酸化的tubulin在轴突中富集，而生长锥中则含有大量酪氨酸化的tubulin，提示轴突中的微管可能较稳定，而生长锥中微管相对不稳定，会更利于其在引导信号诱导下进行生长[3]。

多项证据表明在PD患者细胞内的微管的稳定性发生改变。Salama等[5]利用酶联免疫吸附测定法检测了26个PD患者血浆中的tubulin含量，结果发现PD患者血浆中的tubulin水平显著增高。Esteves等[6]将散发性PD患者血小板中的线粒体转入NT2细胞成为PD胞质杂合细胞，结果发现与健康对照组比较，PD患者胞质杂合细胞中游离tubulin的比例明显升高。Cartelli等[7]分离并培养了散发性PD患者以及富含亮氨酸重复序列激酶2(leucine-rich repeat kinase 2，LRRK2)、Parkin突变的家族性PD患者的成纤维细胞，经检测发现散发性PD和家族性PD患者成纤维细胞中游离tubulin明显升高，同时Parkin突变PD患者成纤维细胞中酪氨酸化的α-tubulin水平明显升高，而散发性PD患者成纤维细胞中去酪氨酸化的α-tubulin水平明显升高，LRRK2突变PD患者成纤维细胞中乙酰化的α-tubulin水平明显升高。上述结果均提示在PD患者细胞内微管稳定性发生了异常。

2.PD相关蛋白对微管稳定性的调节

(1)α-synuclein对微管稳定性的调节:研究发现α-突触核蛋白(α-synuclein)通过其羧基端与tubulin直接作用，且α-synuclein可能只特异性的与tubulin异源二聚体结合，而与已组装的微管并无结合。在体外实验中，生理浓度的α-synucleinn能够促进tubulin聚合，而α-synucleinn突变体A53T和A30P只能使tubulin形成无固定形态的聚集物[8]。Prots等[9]证实α-synucleinn的寡聚物有效抑制了微管的组装。据此推测，在生理条件下，α-synucleinn能够促进微管的组装；而在病理条件下，α-synucleinn的过度表达或突变使得α-synucleinn的蛋白构象或者功能改变，对微管的形成起到抑制作用，但其中的具体机制仍不清楚。Cartelli等[10]发现当α-synucleinn单体与tubulin作用时，α-synucleinn的构象发生改变形成了α螺旋，诱导产生了数目更多但较短的微管，表明α-synucleinn促进了微管的核化过程，从而促进接下来的微管组装；而α-synucleinn的突变体则只能引起tubulin形成聚集，影响了正常的微管组装。

α-synucleinn还可通过作用于Tau以调节微管稳定性。Tau蛋白是一个重要微管组装调节因子。在非磷酸化状态下，Tau可以促进微管的组装，但是当处于磷酸化状态时，Tau与tubulin的结合能力减弱，反而会抑制微管的组装。研究者在α-synucleinn转基因小鼠脑内LB中观察到α-synucleinn和磷酸化状态的Tau共定位，表明两者可能在PD发病中存在一定的联系，且大量证据表明α-synucleinn和Tau之间存在直接相互作用[11]。Oikawa等[12]发现α-synucleinn原纤维能够竞争性的与Tau结合，致使与微管结合的Tau减少，降低微管的稳定性。α-synucleinn的异常表达会诱使细胞内Tau多个位点磷酸化水平升高。1-甲基-4-苯基-吡啶离子(1-Methyl-4-phenylpyridine，MPP+)处理的原代中脑神经元Tau S396/404磷酸化水平升高，而在α-synucleinn基因敲除的神经元中则无法观察到这一现象，提示Tau磷酸化水平升高由α-synucleinn介导[13]。在α-synucleinn转基因小鼠纹状体内，Tau的多个位点包括S202、S262和S396/404磷酸化水平大幅度升高，同时糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase，GSK3β)磷酸化水平明显升高，提示α-synucleinn诱导的Tau磷酸化与GSK-3β的激活相关[11]。Kawakami等[14]则发现α-synucleinn可以和GSK-3β、Tau形成异源三聚体复合物，α-synucleinn对GSK-3β和Tau起到连接作用，促进GSK-3β对Tau的磷酸化。α-synucleinn诱导的Tau高度磷酸化抑制微管的组装，导致细胞内游离形式的tubulin明显增加，细胞骨架的稳定性下降[11]。

(2)LRRK2对微管稳定性的调节:Gandhi等[15]利用Pull-down和质谱实验证实LRRK2和α/β-tubulin二聚体之间有相互作用。LRRK2可以磷酸化β-tubulin，体外微管聚合实验显示LRRK2介导的β-tubulin磷酸化促进了微管聚合[16]。微管稳定对于细胞正常功能起到至关重要的作用，但是微管的过度稳定也会损害细胞功能。研究者在野生型、PD相关的LRRK2突变G2019S和I2020T转基因小鼠内均观察到了微管稳定性增加，但这影响了正常微管网络的形成，导致高尔基体发生片段化。Esteves等[17]给予NT2细胞LRRK2激酶活性抑制剂IN-1处理，结果发现细胞内游离的tubulin水平升高。除了对tubulin的磷酸化修饰，Law等[18]还发现LRRK2对tubulin乙酰化水平有调节作用。他们发现LRRK2基因敲除小鼠胚胎成纤维细胞内α-tubulin乙酰化水平明显高于野生型小鼠。但是，Esteves等[17]则观察到IN-1处理的NT2细胞内α-tubulin乙酰化水平显著降低，因此推测LRRK2对α-tubulin乙酰化水平的调节可能并不是由于其激酶活性。

LRRK2还可能通过作用于微管相关蛋白Tau调节微管稳定性。Kawakami等[19]利用体外实验证实了LRRK2和Tau在tubulin存在的情况下发生相互作用，且LRRK2可直接磷酸化与tubulin结合的Tau，而非游离的Tau，提示LRRK2可能并不直接与Tau发生相互作用，而是需要tubulin作为支架。他们还发现与野生型LRRK2比较，G2019S、I2020T突变均可显著增加Tau的磷酸化水平，降低Tau和微管的结合能力。Bailey等[20]通过进一步研究发现Tau T149、T153、T205、S199/S202/T205残基均可被LRRK2磷酸化。但也有研究对LRRK2对Tau的磷酸化作用有不同观点。Shanley等[21]利用免疫共沉淀实验发现在SH-SY5Y细胞以及小鼠脑内，LRRK2、Tau和细胞周期素依赖蛋白激酶5(cyclin-dependent kinase 5，CDK5)存在相互作用，而利用siRNA干扰细胞内LRRK2的表达导致Tau磷酸化水平明显下降，但是LRRK2激酶活性抑制剂却对并未影响Tau磷酸化水平。体外实验显示LRRK2对Tau的磷酸化作用远远低于CDK5，但是Tau与LRRK2的结合能力约为与CDK5的200倍，因而推测LRRK2可能作为中间支架蛋白促进CDK5对Tau的磷酸化，而非主要的磷酸化Tau的激酶。

(3)Parkin对微管稳定性的调节:Parkin是一种在脑内广泛表达的泛素E3连接酶，介导受损蛋白的泛素化，促使其发生降解，维持蛋白质稳态。Parkin突变失活可导致多巴胺能神经元变性，参与PD的发病过程。有研究发现Parkin和α、β-tubulin均存在强烈的相互作用，在HEK293细胞中过表达Parkin导致α、β-tubulin的泛素化水平明显升高，降解速度增加，提示Parkin可以对α、β-tubulin进行泛素化修饰促进其降解。细胞内大量错误折叠的tubulin单体可导致细胞发生死亡，因而Parkin介导的tubulin的降解对于细胞的存活有重要的生理意义。此外，Parkin还可影响微管的稳定性。Yang等[22]发现Parkin通过linker、RING1和RING2 3个结构域与α/β-tubulin二聚体结合，在COS-7细胞中过表达全长的Parkin或linker、RING1和RING2结构域序列能够明显降低秋水仙碱所诱导的微管解聚，而泛素E3连接酶失活的Parkin突变则对微管稳定性无明显影响，表明Parkin促进微管稳定，但是这一效应并不依赖其泛素E3连接酶活性。

3.诱发PD的毒性物质导致微管稳定性异常:研究发现多种诱发PD的毒性物质均可导致细胞微管稳定性下降。Cartelli等[23]检测发现在MPP+处理的PC12细胞中酪氨酸化的tubulin水平明显降低，且组装进入微管的酪氨酸化的tubulin与游离的酪氨酸化的tubulin的比率明显降低，表明MPP+导致微管稳定性降低。鱼藤酮可以直接与tubulin结合，导致tubulin的解聚，Hongo等[24]发现在鱼藤酮损伤的SH-SY5Y细胞中的游离的tubulin大量增加，而聚合状态的tubulin明显减少。

四、微管稳定性异常参与PD发病

1.微管解聚更易导致多巴胺能神经元受损:黑质多巴胺能神经元拥有更多的轴突分支。在大鼠黑质致密部中约有12000个多巴胺能神经元，平均每个神经元支配102165～245103个突触，据此计算每个黑质多巴胺能神经元轴突总长度约为46.7cm。而其他种类的神经元的神经支配数目远远低于多巴胺能神经元，大鼠GABA能神经元约有5000个突触，而苍白球内的神经元仅有约2000个突触。因此，黑质多巴胺能神经元可能对于微管的损伤更加敏感。Ren等[25]发现利用鱼藤酮或秋水仙碱促使黑质神经元中微管发生解聚，大鼠黑质中TH阳性神经元与TH阴性神经元比较更易发生死亡，利用紫杉醇抑制微管解聚可减轻鱼藤酮对TH阳性神经元的损伤，但对TH阴性神经元的存活影响较小。Cartelli等[26]也发现微管稳定剂埃博霉素D能够有效抑制MPTP诱导的黑质多巴胺能神经元变性死亡。

2.微管稳定性降低促进α-synucleinn聚集:神经元胞质内出现路易小体是PD最重要病理特征之一，路易小体主要是由α-synucleinn大量聚集沉积形成。研究者利用免疫荧光染色检测发现在PD患者迷走神经背侧运动核中tubulin与α-synucleinn同时存在于路易小体中。Kim等[27]在体外实验中发现将α、β-tubulin和α-synucleinn共同孵育，α-synucleinn发生聚集形成不规则的纤维样物质；而微管的组装抑制剂苯菌灵进一步加速了α-synucleinn聚集。Esteves等[6]发现紫杉醇能够有效抑制PD胞质杂合体细胞中α-synucleinn的聚集。上述结果提示，微管的稳定性下降能够促进α-synucleinn的聚集，游离状态的tubulin可能通过和α-synucleinn相互作用改变α-synucleinn的构象从而促使α-synucleinn发生聚集。

3.微管稳定性降低导致线粒体功能受损:Cartelli等[25]观察发现在MPP+损伤的细胞内，微管解聚过程要先于线粒体功能障碍发生，因此推测微管解聚会破环轴突运输过程，使得线粒体在轴突内无法正常运输，从而损伤线粒体功能。Godena等[28]观察到过表达乙酰基转移酶微管蛋白乙酰转移酶(α-tubulin acetyltransferase，αTAT1)以增加tubulin乙酰化水平明显改善了LRRK2突变导致的线粒体运动功能障碍。Esteves等[29]利用davunetide促进微管组装，结果发现davunetide能够明显提高PD胞质杂合体细胞中线粒体运动功能，增加线粒体膜电位。上述结果表明提高微管稳定性可以改善线粒体功能，提示在PD发病过程中微管稳定性下降可能是线粒体功能损伤的重要原因。

五、展 望

综上所述，微管介导神经元极性形成以及轴突运输等神经元功能，而微管稳定性异常可导致神经元功能障碍，从而发生变性。研究结果显示在PD患者细胞内微管稳定性异常，在细胞和动物模型中PD相关蛋白的异常表达以及诱发PD的毒性物质也会导致微管稳定性异常。微管稳定性的异常参与了PD的发病过程，微管稳定性下降会促进细胞内α-synucleinn聚集、线粒体功能受损，而多巴胺能神经元拥有更多的轴突分支这一特殊形态导致其更易因微管稳定性下降受损。因此，以微管的稳定性作为要为药物靶点对于PD的治疗有着重要意义。事实上已经在多种实验模型中证实微管稳定剂如紫杉醇、埃博霉素D等对于多巴胺能神经元的保护作用。但是，紫杉醇无法穿过血-脑脊液屏障进入中枢神经系统，因而无法用于治疗PD，目前多个研究正致力于对紫杉醇进行修饰以使其能够进入中枢神经系统。埃博霉素D能够穿过血-脑脊液屏障，但用于早期阿尔茨海默病患者治疗的临床实验时，埃博霉素D引起了强烈的不良反应。近年来人们设计了一种新型的微管稳定剂NAP，NAP是一段与微管作用的肽段，可改善过表达α-synucleinn的小鼠的运动功能障碍，但NAP仍未能应用于临床。因此，在未来进一步阐释微管参与PD的发病机制，并且以微管为靶点开发新药物将会是一个重要的研究方向，对于PD的治疗具有指导意义。