微管正端示踪蛋白与神经系统疾病

宋彬彬 王玉波 贾炳泉 于 佳

微管是真核细胞中普遍存在的纤维网状结构，散布于胞质中，参与细胞支撑、细胞迁移、细胞分裂、胞内运输等过程，对于维持细胞结构和功能具有重要作用。微管是由13条原纤维(protofilaments)构成的直径约22～25nm的中空管状结构，每条原纤维由α-和β-微管蛋白(tubulin)头尾相连形成的二聚体线性排列而成。且tubulin二聚体排列具有极性，使微管也具有极性，分为负端和正端：负端集中于近核区的微管组织中心(MT-organizing center，MTOC)，最末端为α-tubulin，聚合速度慢，较稳定；正端向外延伸，最末端为β-tubulin，聚合速度快，处于动态的聚合和解聚转换状态，即微管正端的动态不稳定性(dynamic instability)，使微管正端快速伸长或收缩，调节微管形态[1]。多种与微管结合的蛋白可特异性定位于微管正端，为微管正端示踪蛋白(plus-end tracking proteins，+TIPs)，+TIPs可形成复杂的相互作用网络，调节微管的结构和功能。神经元体积较大，轴突和树突分支较多且长，因此更为依赖微管。+TIPs突变或表达水平变化与肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)、阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)和无脑回畸形(lissencephaly)等多种神经系统疾病相关。本文就多种+TIPs的结构、功能，及其相关神经系统疾病进行综述。

一、微管正端示踪蛋白结构和功能

神经元中+TIP种类较多，目前可分为两大类：微管末端结合蛋白(end-binding proteins，EBs)依赖性+TIPs(EBs-dependent +TIPs)以及EBs非依赖+TIPs(EBs-independent +TIPs)。

1.微管末端结合蛋白(end-binding proteins，EBs):是+TIPs中含量最多的蛋白，自主定位于微管正端，并可与其他+TIPs相结合。哺乳动物中EBs蛋白主要有EB1、EB2和EB3，三者都可与微管正端结合，但与微管以及+TIP的亲和力不同，EB1和EB3高于EB2。EBs 蛋白N端的CH(calponin homology)结构域具有MT亲和能力，介导与微管正端的结合；C端的卷曲螺旋结构域(coiled-coil doamin，CCD)负责EBs单体的二聚化；保守的EB同源结构域(end binding homology domain，EBH)与CCD部分重叠；C端最末为高度保守的EEY/F序列。EBs主要作为微管正端的支架蛋白(scaffolding proteins)位于+TIP的中心，结合在微管正端的EBs可与胞质快速交流，为蛋白质快速结合提供平台，有效形成和维持微管正端的完整性和功能，对于神经元结构和功能有重要作用。EBs可识别微管正端最末端蛋白，促进GTP水解，调节蛋白结构转换和微管动力学[2]。Komarova等[3]研究发现体外培养的CHO-K1细胞中EB1和EB3可抑制微管崩解，促进微管持续增长。

2.微管末端结合蛋白依赖性微管正端示踪蛋白:根据+TIP与EBs结合方式，其可被分为两大类，一类是具有高度保守CAP- Gly结构域(cytoskeletal-associated protein glycine-rich domain)的+TIPs，可以与EB和微管蛋白羧基端的EEY/F修饰相结合。二类是具有SxIP基序(serine/threonine-any amino acid-isoleucine/leucine-proline motif)的+TIPs，种类较多，SxIP基序可以与EBs的EBH结构域结合。

(1)CAP-Gly结构域蛋白:细胞质连接蛋白(cytoplasmic linker protein，CLIPs)主要包括CLIP170和CLIP115，富集于轴突生长锥，调节微管稳定性和轴突的形成，其中CLIP170可与肌动蛋白actin结合蛋白IQGAP1协同作用调节树突的形态，是重要的细胞极性调节因子。CLIP170的N端具有CAP-Gly结构域，可以与EB1和α-tubulin的C端EEY/F 修饰结合；C端具有两个锌结合域(zinc-binding domains)和EEY/F修饰，可与具有CAP-Gly结构域的+TIPs相结合。CLIP115与CLIP170的N端相似，但缺失CLIP170的C端结构域及功能。Komarova等[4]研究发现CHO-K1细胞中微管正端CLIPs表达水平下降引起动力蛋白激活蛋白dynactin最大亚基p150glued在微管正端定位减少，微管修复(rescue)速率显著下降，微管寿命变短。

p150glued是由DCTN1基因编码的，定位于微管正端。p150glued的N端具有CAP-Gly结构域，可与含有EEY/F序列的微管蛋白α-tubulin以及EB1和CLIP170直接结合；C端的CC1结构域可与动力蛋白dynein的中链(intermediate chain，IH)结合。其中p150glued CAP-Gly结构域与微管直接结合力较弱，EB1、CLIP170和p150glued相互作用可以增强p150glued在微管正端的定位，抑制微管正端崩解(microtubule catastrophe)。本研究发现9月龄p150glued微管结合功能缺失小鼠模型的脊髓组织中乙酰化α-tubulin水平增加，提示p150glued可调节微管稳定性变化[5]。

(2)包含SxIP基序蛋白:细胞质连接蛋白(cytoplasmic linker protein-associated proteins)具有CLASP1和CLASP2两个亚型。CLASP1广泛表达，CLASP2主要表达于神经系统。CLASPs不仅可与CLIPs结合，其具有SxIP基序可以与EB1结合；具有3个TOG(tumor overexpressed gene)样(TOG1/TOG2/TOG3)结构域可以捕获动态的微管末端。研究发现，CLASP2的TOG2结构域与微管正端结合后可促进微管重建，抑制崩解。敲减CLASPs的MDA-MB-231细胞中过表达EB3可增加微管解聚药物秋水仙素(colchicine)诱导的微管正端崩解的频率；过表达TOG2可抑制崩解[6]。

血影斑蛋白(spectraplakins)家族包含微管微丝交联因子(microtubule-actin crosslinking factor proteins 1/2，MACF1/2)是一种细胞骨架交联蛋白，可与中间纤维、肌动蛋白(actin)相互作用，调节胚胎发育、细胞迁移和极化。spectraplakins蛋白 C端GAR结构域(growth arrest-specific 2 protein-related region)和SxIP基序可与微管结合。研究发现，小鼠和果蝇神经元中spectraplakins水平下降使微管不能成束，轴突变短。小鼠脑发育过程中，敲减MACF1可使乙酰化微管蛋白水平下降，动态微管聚合解聚增强。抑制皮质椎体神经元迁移，引起神经元定位异常[7]。

p140Cap(cas-associated protein)是重要的接头蛋白，对于细胞的黏附和生长具有重要作用。p140Cap具有SxIP基序，可与定位于微管正端的蛋白EBs相结合。研究发现，海马神经元中p140Cap与EB3相互作用可以调节微管以及树突棘的数量和形态，敲减p140Cap可破坏其与EBs间作用，影响微管和微丝细胞骨架结构，使树突棘数量明显下降，伪足增加[8]。

tau微管蛋白激酶(tau-tubulin kinase 1/2，TTBK1/2)属于酪蛋白激酶1(casein kinase1，CK1)家族，二者具有高度同源的催化结构域和SxIP基序，非催化结构域存在差异。TTBK1特异性表达于中枢神经系统，参与tau的磷酸化和积聚，其主要使tau Ser422位点磷酸化，并且可激活细胞周期蛋白依赖激酶5 (cycline-dependent kinase 5，CDK5)等，调节信号通路，影响微管稳定性[9]。TTBK2广泛表达，可磷酸化tau Ser208和Ser210等位点。且TTBK2以EB1/3依赖方式促使微管解聚蛋白KIF2A的S135位点磷酸化，抑制微管的解聚，而TTBK2缺失可阻碍微管的重建[10]。

在教学设计与评价上的主要特点 教学设计从普通的到信息化教学设计，教学评价从单一的、统一的到多元的、有针对性的评价。信息化教学设计涉及翻转课堂和微课程的教学设计，以及其他信息化教学手段的教学设计；而教学评价在传统的考试基础上增加了档案袋评价、概念图评价、项目评价以及在线考试等方式。

皮层蛋白结合蛋白2(CTTNBP2)为神经元特异性F-actin调节蛋白，具有SxIP基序可与EB结合定位在微管正端。神经元发育过程中，CTTNBP2 的N端双螺旋结构域(coiled-coil motifs，NCC)可调节CTTNBP2 寡聚体的形成；CTTNBP2中间结构域(middle region，Mid region)可与微管相互作用，并通过CTTNBP2寡聚体诱导微管成束，从而调节微管稳定性和树突脊的形成[11]。

结肠腺瘤性息肉病蛋白(adenomatous polyposis coli，APC)为微管正端支架蛋白，主要位于大脑皮质，其C端具有SxIP基序，使其聚集于微管正端。APC为RNA结合蛋白，可调节β2B-tubulin mRNA的表达，促进tubulin合成。β2B-tubulin主要定位于生长锥的微管动态区， APC与β2B-tubulin mRNA的结合受损可引起微管结构异常和细胞迁移障碍[12]。

3.微管末端结合蛋白非依赖性微管正端示踪蛋白：lissencephaly-1(LIS1)蛋白高度保守，N端具有双螺旋结构域(coiled-coil domain，CCD)调节二聚体的形成；C端具有7个WD40重复序列，可与tubulin、dynein/dynactin和CLIP170相互结合，调节微管动力学，抑制微管正端的崩解。LIS1参与调控神经祖细胞的分裂、神经细胞的迁移、突触的形成和胞内轴突运输等过程，对于脑的发育具有重要作用。LIS1缺失的纯合小鼠胚胎期死亡，LIS1缺失NIH3T3细胞中微管结构受损[13]。体外培养鸡E10～E13胚胎期感觉神经元，加入适量laminin后，dynein和tubulin快速到生长锥，微管正端的dynein可招募dynactin和LIS1，促进轴突延伸；抑制LIS1或dynein功能使微管不能成束，阻碍轴突延伸。海马神经元中，LIS1、dynein和dynactin富集于生长锥，沉默LIS1的表达使微管散乱分布，干扰生长锥形成、轴突延伸以及突触形成[14]。

kinesin4家族蛋白kinesin21A由驱动结构域、杆部双螺旋结构域以及尾部WD40重复序列组成。WD40重复序列可与+TIPs相互作用使kinesin21A定位在微管正端，kinesin21A也可与微管结合蛋白1b(microtubule-associated protein 1b，Map1b)相互作用，抑制微管生长和突变(catastrophes)[15]。

二、微管正端示踪蛋白参与神经系统疾病的发生

微管是重要的神经元骨架，调节神经元发育、极化、信号转导和胞内运输等生理活动。微管正端示踪蛋白对于神经退行性变和神经发育异常等神经系统疾病的发生、发展有重要作用。

1. 神经退行性疾病:肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)是最常见的运动神经元病，患者皮质、脑干和脊髓的运动神经元特异性变性死亡，导致四肢、躯干、胸部等肌肉逐渐萎缩无力。ALS中5%～10%为家族性患者，DCTN1是其致病基因之一。研究发现，ALS患者中存在DCTN1 R1101K、T1249I、M571T和R785W等突变型，且DCTN1功能缺失的运动神经元中出现轴突运输障碍、神经肌肉接头去神经支配、微管稳定性和自噬异常等ALS病理表现，而DCTN1突变或缺失引起运动神经元特异性损伤可能是由于运动神经元体积较大，轴突较长，分支较多，对于细胞骨架和轴突运输的改变更为敏感[5，16]。远端型遗传性运动神经病(distal hereditary motor neuropathy，dHMN)也属于运动神经元病。dHMN 具有多种亚型，其中dHMN 7B型(distal hereditary motor neuropathy type 7B)是由DCTN1 G59S突变引起的[17]。

佩里综合征(Perry syndrome)是一类伴发抑郁、体重减轻和肺换气不足等症状的帕金森综合征，患者黑质和蓝斑部位的神经元大量变性死亡。研究发现，DCTN1是佩里综合征的致病基因，与佩里综合征相关的p150glued突变主要发生在其N端的CAP-Gly结构域。DCTN1G71A突变型佩里综合征小鼠模型早期(6月龄)活动能力下降，晚期(16月龄)运动协调动能障碍[18]。目前为止，与佩里综合征有关的DCTN1突变型为F52L、G67D、G71A/E/R、T72P、Q74P和Y78C。

阿尔茨海默病是痴呆的常见类型，主要累计海马、大脑皮质和皮下组织，病理表现为tau高度磷酸化形成神经纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFTs)，临床表现为进行性记忆衰退、慢性认知功能障碍、语言和社交功能减退等。研究发现，TTBK1及其变体与AD发生相关。TTBK1是神经元特异性激酶，可以磷酸化tau的AD相关位点AD患者脑中TTBK1水平显著提高，tau Ser422位点磷酸化增强[19]。TTBK1转基因小鼠记忆障碍，脑中磷酸化NFTs积聚，海马区CDK5和calpainⅠ活性增强，NMDA receptor types2B(NR2B)水平下降，这提示TTBK1可能通过调节CDK5和calpain的活性而与AD发生相关。

2.神经发育相关疾病:威廉斯综合征(Williams syndrome)为神经发育障碍引起。威廉斯综合征染色体异常区域包含CLIP115蛋白的编码基因CYLN2。CLIP115敲减小鼠具有生长缓慢、大脑异常、海马区功能障碍和运动协调缺陷等威廉斯综合征症状。CLIP115缺失的小鼠成纤维细胞中微管增长率未发生明显变化，但CLIP170和dynactin与微管正端结合显著增多，可能改变胞内逆向轴突运输。

常染色体隐性智力障碍(autosomal recessive intellectual disability，ARID)是指发育过程中出现智力功能明显低于同龄水平及社会适应能力显著减弱。Larti等[20]通过基因测序法研究发现伊朗一ARID患者家族中出现CLIP170的无义突变p.Q1010*；ARID患者的淋巴母细胞中CLIP1基因(CLIP170编码基因)转录和蛋白水平下降；皮肤成纤维细胞中微管正端只发现野生型(未突变型)CLIP170，提示CLIP170缺陷可能引起ARID。

自闭症/孤独症(autism)是广泛性发育障碍的代表性疾病。研究发现自闭症患者中存在CTTNBP2L1213V突变型及其内含子2中鸟苷酸突变为胸腺嘧啶。此外，研究发现APC功能缺失型突变与识别和自闭症样疾病(cognitive and autism-like disabilities)发生相关。条件性敲除前脑神经元中APC的小鼠模型学习和记忆功能障碍，伴随重复行为增加，社会兴趣减少等自闭症表现，这可能是由于突触结构和功能异常引起的[21]。

无脑回畸形(lissencephaly)一般是由妊娠期12～24周神经元迁移缺陷引起脑沟和脑回发育缺陷，病理表现为脑回完全消失，脑表面光滑，也称光滑脑。临床患者通常伴随不同程度的精神、运动和智力障碍。LIS1缺失或突变是引起无脑回畸形主要原因之一。LIS1相关无脑回畸形包括isolated lissencephaly sequence(ILS)、皮质下带异位症(subcortical band heterotopia，SBH)和Miller-Dieker综合征(Miller-Dieker syndrome，MDS)。Nataliya等研究811位无脑回畸形患者发现，81%具有基因突变，且LIS1基因突变最多，占40%。研究发现，无脑回畸形中LIS1主要可发生错义突变(T 92C、A 446G等)、无义突变(C 265T、C 430T等)、移码突变(154-155 ins A、162-163 ins A等)、剪切突变(c.569-10T > C、c.900+1G> A等)和部分缺失突变。

先天性眼外肌纤维化1型 (congenital fibrosis of the extraocular muscles type 1，CFEOM1)主要是由于轴突寻路缺陷 (axon pathfinding defects)引起动眼神经发育缺陷，使眼睛运动障碍。研究发现，CFEOM1患者中存在KIF21A突变型如R954W(约70%)、R954Q、E944Q和M356T等。KIF21A R954W knock-in小鼠模型的神经元发育过程中，动眼神经较细，分支异常，表现出动眼神经和运动神经元数量减少，上睑提肌变小，去神经支配等CFEOM1表征。KIF21A突变使其与微管结合增强，可能通过功能获得方式引发CFEOM1[22]。

3.神经肌肉系统疾病:MACF1缺陷与神经肌肉系统疾病相关。MACF1缺失的纯合体小鼠胚胎期死亡。特异性抑制小鼠神经系统中MACF1的活性可使细胞迁移受损，大脑结构紊乱，小鼠出生24～36h后呼吸衰竭而死。

MACF2缺陷与遗传性感觉自主神经病(hereditary sensory and autonomic neuropathy，HSANs)和肌张力障碍(dystonia)有关。HSANs是由遗传因素引起的以周围神经受损为主的疾病。患者刺痛、虚弱、感觉疼痛和冷热能力降低，可致四肢末端反复发作性无痛性溃疡，致步态不稳等。研究发现HSANs患者中存在MACF2突变，使其转录异常；MACF2敲减的小鼠模型神经异常、肌肉挛缩。肌张力障碍是由于肌肉收缩不协调引发的运动障碍综合征。MACF2异常可引起肌张力障碍，MACF2缺失的小鼠模型感觉神经元变性，共济失调，且感觉神经元中自噬小体积累，自噬溶酶体和受损线粒体数量增加，提示MACF2异常可能通过引起自噬障碍而导致疾病[23]。

三、展 望

微管为神经元的细胞骨架和轴突运输轨道，对于维持神经元的生长和功能具有重要作用。+TIPs种类较多，作用复杂，可调节和维护微管的正常结构和功能，对于细胞迁移、神经元极化以及突触形成和功能等具有重要作用，其表达异常参与多种神经系统疾病的发生。本课题组研究发现，微管正端示踪蛋白的突变或功能缺失与运动神经元变性死亡紧密相关，其具体分子机制是进一步研究方向。随着分子生物学和神经生物学等研究技术的发展，可深入研究+TIPs的生理功能及其参与神经系统疾病的病理基础和分子机制，对于临床疾病的防治提供一定的参考意义。