SIRT1调节昼夜节律的研究进展

韦 晓，茅晓东，徐一娇，陈国芳，刘 超

(南京中医药大学附属中西医结合医院内分泌科 江苏省中医药研究院瘿病证治重点研究室，南京 210028)

地球上的生命受昼夜交替所造成的明暗循环支配，包括从原核生物到人类的几乎所有生物体中，均进化出了一套昼夜节律系统[1]。昼夜节律调控了生物体的许多生理活动，如体温、进食、睡眠和激素变化等，这些生理变化遵循一个约24 h的内在周期，生物体可以通过昼夜节律系统更好地适应生存环境[2]。昼夜节律系统的稳定对健康和寿命非常重要，节律的紊乱会导致失眠、抑郁、冠心病、代谢综合征、神经退行性疾病和肿瘤的发生，这些疾病的发生发展诱导了机体老化，加速了衰老性疾病的进程[3]。因此，阐明昼夜节律的分子机制，寻找改善节律紊乱的治疗靶点，对预防和治疗衰老性疾病具有巨大的应用价值。乙酰化和去乙酰化调节是调控昼夜节律的重要分子机制，而沉默信息调节因子1(silent information regulator 1，SIRT1)是一种去乙酰化酶，它可以通过去乙酰化昼夜节律相关蛋白影响昼夜节律。研究发现，上调SIRT1的表达可以缓解多种衰老性疾病，如心血管疾病、神经退行性疾病、代谢性疾病和肿瘤等，SIRT1可能通过调控昼夜节律发挥以上作用[4]。现就SIRT1调节昼夜节律的研究进展予以综述。

1 昼夜节律的生理基础

哺乳动物体内控制昼夜节律的器官为下丘脑的视交叉上核，视交叉上核中约包含15 000个神经元，它们可以感受周围环境中的光照变化，通过光照的周期性改变调节生物的昼夜节律性[5]。除光照因素外，视交叉上核还受松果体、下丘脑、血管活性肠肽和激素(皮质醇激素和褪黑素等)的影响，这些因素均会影响生物的昼夜节律性[6]。昼夜节律性不只体现在视交叉上核，外周组织也具有自身的昼夜节律性，如肝脏和白色脂肪组织，昼夜节律是一个遍布全身的网络系统[7]。昼夜节律的紊乱会加速衰老，许多衰老性疾病的发生均与昼夜节律的紊乱相关[2]。有观点认为，昼夜节律失衡是衰老的关键因素[7]。

2 昼夜节律的分子基础

在分子水平上，昼夜节律受到一组节律相关蛋白表达的影响，这些蛋白影响了10%～15%的基因并以昼夜节律的方式转录，节律相关蛋白的周期循环表达对昼夜节律的形成至关重要[8]。

昼夜节律运动输出周期故障(circadian locomotor output cycles kaput，CLOCK)是昼夜节律的核心调控蛋白，它由clock基因编码，在各个器官与组织中表达，人的clock基因位于第4号染色体长臂(4q12)[9]。CLOCK的C端与组蛋白乙酰化酶具有同源性，它能催化组蛋白H3和脑和肌肉组织芳香烃受体核转运蛋白的类似蛋白1(brain and muscle ARNT-like protein 1,BMALl)的乙酰化，且BMAL1的乙酰化必须有CLOCK存在[10]。CLOCK和BMAL1同属于碱性螺旋-环-螺旋家族蛋白，它们具有保守的碱性螺旋-环-螺旋和周期蛋白-芳香烃受体核转运蛋白-类泛素蛋白相互作用基序结构域。CLOCK和BMAL1会形成含有碱性螺旋-环-螺旋-周期蛋白-芳香烃受体核转运蛋白-类泛素蛋白相互作用基序结构域的异二聚体复合物，CLOCK/BMAL1复合物可以与调控基因上的E-box元件结合，激活下游基因的表达[11]。

除CLOCK和BMAL1外，哺乳动物体内还发现多种昼夜节律相关蛋白，如周期蛋白、隐花色素和核受体亚家族1D组成员1等[12]。其中，周期蛋白蛋白分为周期蛋白1、周期蛋白2、周期蛋白3三种类型，隐花色素蛋白分为隐花色素1和隐花色素2两种类型，这些蛋白的周期性变化产生了昼夜节律性振荡。

3 昼夜节律的分子机制

昼夜节律相关基因的表达受乙酰化与去乙酰化酶的调控，并存在负反馈环路调节[13]。CLOCK/BMAL1复合物与待表达基因上的E-box顺式作用元件结合后，CLOCK发挥乙酰化作用，乙酰化BMAL1、组蛋白H3和组蛋白H4，启动周期蛋白、隐花色素、核受体亚家族1D组成员1等蛋白的合成，合成后的周期蛋白和隐花色素形成异二聚体，受乙酰化BMAL1的招募转移到细胞核内，反馈性抑制CLOCK/BMAL1复合物的作用。此时，去乙酰化酶发挥作用，其将周期蛋白、BMAL1、组蛋白H3和H4的乙酰化位点去乙酰化，从而终止目的基因转录[14]。同时，核受体亚家族1D组成员1会与下游基因的受体酪氨酸激酶样单受体应答元件结合，抑制基因的转录。

CLOCK/BMAL1异二聚体调控钟控基因的转录，而钟控基因又反过来影响CLOCK/BMAL1复合物乙酰化的振荡机制，这种内在的分子机制调控的基因存在一个24 h的表达周期，它在宏观上调控了进食、激素、体温和代谢等多种生理功能[15]。

参与昼夜节律的去乙酰化酶为SIRT1，它是一种依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)的组蛋白去乙酰化酶，其作用与CLOCK相反，可以去乙酰化组蛋白H3的赖氨酸-9和赖氨酸-14[16]。SIRT1除可以去乙酰化组蛋白外，还可以去乙酰化多种胞质蛋白，如p53蛋白、叉头框蛋白O1和低氧诱导因子1α等，它是细胞代谢的重要调控蛋白，具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、延长寿命的作用[17]。

SIRT1是细胞内重要的去乙酰化酶，而乙酰化修饰结构域存在于多种组蛋白分子中。CLOCK/BMAL1复合物与SIRT1通过乙酰化与去乙酰化组蛋白的方式调控染色质异构的变化，达成基因的节律性表达[18]。CLOCK/BMAL1复合物指导组蛋白H3在赖氨酸-9和赖氨酸-14的乙酰化，这种组蛋白翻译后修饰与昼夜节律基因的表达密切相关。有研究证明，组蛋白H3的丝氨酸-10磷酸化与赖氨酸-14的乙酰化具有相关性，且H3的磷酸化作用先于乙酰化，H3的磷酸化可能更有利于CLOCK/BMAL1复合物的结合[19]。此外，组蛋白甲基化对乙酰化也具有影响，有学者在基因增强子人类同源物2的表达中发现，组蛋白H3的赖氨酸-27位点的甲基化有助于基因表达的启动；在昼夜节律蛋白中发现，组蛋白H3的赖氨酸-27甲基化也参与per1和per2基因的表达调控[20]。

4 SIRT1与昼夜节律

自2002年起，昼夜节律调控的分子机制被逐渐阐明，CLOCK作为乙酰化酶的核心机制被不断揭示，但去乙酰化过程研究相对较少。SIRT1作为昼夜节律调控中的关键去乙酰化酶需要更多的深入研究，探寻反馈调节中去乙酰化作用的细节和规律。

SIRT1为哺乳动物体内的Sir2同源蛋白，Sir2在酵母、线虫和果蝇体内被发现，它可以被热量限制激活，延长寿命[21]。在酵母菌中，Sir2介导端粒的转录沉默并调节衰老速度，它通过去乙酰化沉默细胞内的基因表达，调控细胞的代谢过程[22]。在哺乳动物体内有7种Sirtuins家族蛋白，分别被命名为SIRT1～SIRT7，其中SIRT1被研究得最为透彻，它在对抗衰老性疾病的研究中发挥重要作用，可以调节多种代谢过程[16]。SIRT1在低营养环境下被激活，如禁食和热量限制，它的激活有利于动物在这些条件下生存，故SIRT1被认为是研究代谢与衰老关系的重要连接[23]。SIRT1的去乙酰化存在于胞核和胞质中，在细胞核中，SIRT1可以去乙酰化组蛋白H3赖氨酸-9和赖氨酸-14、H4组蛋白赖氨酸-16[24]；在细胞质中，它可以去乙酰化p53、叉头框蛋白O1、过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α和肝X受体[25]。因此，SIRT1具有广泛的调节代谢作用。

Nakahata等[26]发现，SIRT1可以去乙酰化BMAL1，并调节其功能。SIRT1的缺乏会导致昼夜节律的紊乱，如果敲除sirt1基因，per基因的表达会发生变化，导致昼夜节律的延长，从而影响生物体的寿命。另一方面，Asher等[27]报道SIRT1在小鼠成纤维细胞和肝细胞中调控昼夜节律相关蛋白，表明SIRT1和昼夜节律蛋白具有相互作用。研究发现，SIRT1具有昼夜节律调控器的作用，它调节了昼夜节律蛋白的表达，尤其是对组蛋白H3乙酰化的调控[28]。而sirt1基因的敲除或抑制其表达会影响组蛋白H3和BMAL1的去乙酰化[29]。在sirt1基因敲除小鼠的肝脏细胞中，昼夜节律转录周期不稳定，早期转录增加，后期转录减少[30]。此外，在sirt1基因敲除小鼠的胚胎成纤维细胞中，组蛋白H3赖氨酸-9和赖氨酸-14呈高乙酰化[31]。在特异性敲除sirt1基因的小鼠肝脏细胞中，BMAL1的乙酰化增加，证明SIRT1有助于体内昼夜节律的调控[32]。因此，SIRT1作为昼夜节律的振荡器，其将细胞内的代谢信号附加昼夜节律性，这种节律性是否稳定与衰老性疾病具有很强的关联。

5 NAD+与昼夜节律

SIRT1的作用受NAD+的影响，NAD+是许多酶发挥作用均必须存在的辅酶，它由色氨酸前体、烟酸和烟酰胺合成生成，哺乳动物NAD+的合成途径分为从头合成途径和维生素B12转化途径[33]。在SIRT1的去乙酰化过程中，烟酰胺从NAD+中释放，SIRT1将底物的乙酰基转移到NAD+上并去乙酰化，生成代谢产物O-胰腺-ADP核糖，烟酰胺和O-胰腺-ADP核糖在烟酰胺磷酸核糖转移酶(nicotinamide phosphoribosyl transferase，NAMPT)的作用下重新合成NAD+[34]。

NAMPT为NAD+的合成酶[35]。有研究发现，小鼠体内的NAMPT/NAD+显示出昼夜节律性，在黑暗期开始之前，NAMPT蛋白水平降低，这与小鼠开始进食的时间一致，提示营养激增或摄食行为可能对NAMPT蛋白的表达进行调节[36]。即使小鼠持续存在于黑暗环境，NAMPT表达的振荡性依然存在，说明NAMPT的表达存在昼夜节律性。此外，NAD+的表达水平与NAMPT的表达呈现相同的振荡周期。基于这种振荡周期，一种NAMPT/NAD昼夜调控系统被提出，这种调控系统在胰岛β细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞和血管上皮细胞等中均被证实存在节律性[37]。

NAMPT分为细胞内和细胞外两种形式，其中细胞外NAMPT是一种分泌蛋白，有助于NAD+的细胞外合成，所以血清中也可以检测到NAD+的存在。NAMPT被证明在SIRT1的功能活性中发挥重要作用[38]。在小鼠体内，增加NAMPT的表达可以增加细胞内NAD+和SIRT1的活性[39]；在血管平滑肌细胞中，增加NAD+可以对抗衰老延长寿命[40]；在胰岛β细胞中，NAMPT/NAD和SIRT1对胰岛素的合成和分泌也有调控作用，NAMPT/NAD系统介导的SIRT1活性可以协调昼夜节律、细胞代谢和延缓衰老[38]。

内源性NAMPT缺乏的组织可能更多的依赖外源性NAMPT，如果外源性NAMPT发生变化，会直接影响这些缺乏内源性NAMPT组织的昼夜节律性[39]。因此推测，缺乏内源性NAMPT的组织对昼夜节律的影响非常敏感，外周NAMPT水平降低会直接导致这些组织器官的SIRT1活力下降，昼夜节律性丧失。如胰岛β细胞可能依赖外源性NAMPT调节SIRT1活性，有研究证明，服用烟酰胺单核苷酸可使老龄小鼠体内葡萄糖刺激的胰岛素分泌水平恢复到较高水平[38]。因此，胰岛β细胞功能的损伤很可能与NAMPT/NAD系统调节的SIRT1相关，这种损伤直接影响了代谢系统的紊乱。

6 SIRT1调节昼夜节律的干预手段

作为调控昼夜节律的去乙酰化酶，越来越多的证据证明，SIRT1是改善昼夜节律的重要作用靶点[41-43]。已知许多干预手段可以通过激活SIRT1调节昼夜节律，如热量限制、白藜芦醇和褪黑素。

热量限制为在不缺少必需营养物质的情况下，减少进食总热量的干预手段，这种干预被证明可以延缓衰老，并在多种物种中得到证实，如酵母、果蝇、线虫、鱼、大鼠、小鼠、仓鼠、犬和猴[44]。为研究昼夜节律与衰老之间的作用关系和分子机制，Sato等[44]比较了年轻和年老小鼠的基因转录本，结果发现年老小鼠的节律性转录基因只有年轻小鼠的25%左右，其原因可能为细胞内NAD+水平降低和组蛋白乙酰化异常。而限制了30%进食的年老小鼠与年轻小鼠的转录本趋于一致，提示热量限制可以重构基因表达的节律性[45]。这些结果证实，热量限制可以通过调控昼夜节律缓解衰老的进程。在另一项研究中，Solanas等[46]探讨了干细胞的昼夜节律与衰老之间的联系。结果显示，成体干细胞负责维持组织和器官的功能稳定，成体干细胞的功能和数量下降是衰老的重要因素，但成体干细胞的昼夜节律失衡会诱发细胞内的氧化应激和内质网应激。研究显示，热量限制可以降低年龄因素导致的细胞内氧化应激、内质网应激和蛋白异常积累，并提高蛋白的新陈代谢周转率[47]。虽然热量限制改善细胞生理活动的分子机制尚不完全清楚，但其有益效果与SIRT1的增加和激活相关。

热量限制是一种有效对抗衰老的策略，但限制的程度和时间没用明确标准，且这种干预难以被患者坚持，故研究热量限制模拟剂成为研究热点。其中，有些化合物可以模拟热量限制的作用，达到改善代谢、延长寿命的效果[41]。如白藜芦醇是研究最多的热量限制模拟剂，它是一类植物多酚，化学名为3,4′,5-三羟基芪，主要存在于桑葚、虎杖、花生、葡萄等植物中。Sun等[48]研究发现，白藜芦醇可以修复高脂饮食引起的昼夜节律紊乱。高脂饮食可以诱导C57BL/6小鼠的节律相关基因表达受损和脂代谢受损，而白藜芦醇治疗可以改善C57BL/6小鼠体内的sirt1、clock、bmal1、per2基因表达，提示白藜芦醇可通过影响昼夜节律恢复小鼠的正常脂代谢。

除白藜芦醇被发现可以修复基因转录的昼夜节律性外，褪黑素也被证实可以改善昼夜节律性[42]。褪黑素是松果体分泌的吲哚类激素，它的合成主要受光照周期的调控。哺乳动物体内褪黑素的分泌存在一个24 h的节律，但随着年龄的增长，褪黑素的分泌周期会越来越不稳定，这表明褪黑素与衰老性疾病之间存在联系。随着年龄的增加，褪黑素的分泌缺失会诱导昼夜节律的紊乱，导致各种基因表达的不协调，使机体健康情况下降[49]。有学者利用衰老模型SAMP8小鼠进行研究发现，SIRT1和褪黑素存在联系[50]。褪黑素通过激活SIRT1，去乙酰化组蛋白，调控下游基因的表达，如过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α、叉头框蛋白O1、核因子κB和p53。虽然褪黑素和SIRT1之间的关系需要更多研究证实，但这种联系可能成为调控昼夜节律、对抗衰老、神经保护和癌症治疗的重要研究方向。

热量限制、白藜芦醇和褪黑素对衰老相关的生理功能具有广泛影响，如调节代谢水平、调节线粒体功能、抗氧化保护，以延缓衰老相关疾病，这些保护作用与SIRT1的激活以及昼夜节律的稳定相关，可作为治疗衰老性疾病的有效手段。

7 小 结

昼夜节律与细胞和器官的功能紧密结合，调控着关键的代谢过程和生理途径。因此，揭示控制昼夜节律的分子机制将成为研究细胞代谢的关键。乙酰化和去乙酰化调节为昼夜节律调控的开关，作为此过程中的去乙酰化酶，SIRT1作用的规律需进一步研究，且激活SIRT1的药物或干预方式，如热量限制、白藜芦醇需要更多的临床证据证明其有效性，以为更好地改善昼夜节律、预防和治疗衰老性疾病提供临床依据。在基础研究中，已明确SIRT1可以调控昼夜节律，未来需深入探讨其在昼夜节律导致的衰老性疾病中的分子机制。