脓毒症氨基酸代谢变化及检测方法的研究进展

熊梓宏，张国英，任兴琼，张 宁，周 芹，卢 宾

(成都市妇女儿童中心医院儿童重症医学科，成都 610091)

脓毒症是人类死亡的主要原因，也是世界范围内危重症救治的难点之一。脓毒症患者机体出现失控的炎症反应和自身免疫功能紊乱，常伴随食欲减退或无法进食，机体蛋白质消耗增加且合成不足，导致继发营养不良和免疫功能紊乱的概率大大增加[1-2]。目前，在脓毒症患者集束化治疗中，除强调积极抗感染、机械通气和脏器支持治疗外，补充适当的营养物质可以促进患者器官保护和免疫功能改善，缩短脓毒症患者的住院治疗时间，降低死亡率，故营养支持治疗得到更多关注，成为脓毒症治疗的研究新热点[3]。氨基酸作为人体重要的必需营养元素，具有其特有的生理、生化、免疫等功能，氨基酸代谢紊乱的严重程度可直接影响脓毒症患者的预后，因此，研究脓毒症时重要氨基酸的代谢变化，可指导临床医师选择合适的脓毒症炎症急性期静脉营养支持方案以及氨基酸制剂，为脓毒症患者提供更精准有效的营养治疗方案，及时纠正全身和肌肉蛋白质的损失[4]。现对脓毒症患者机体重要氨基酸的代谢变化及氨基酸检测方法的研究进展予以综述。

1 脓毒症患者机体中重要氨基酸的代谢变化

1.1谷氨酰胺 随着脓毒症的进展，患者常出现免疫功能紊乱，机体产生大量的氧自由基，免疫功能下降和过氧化均可引发机体对感染的反应失调并诱发器官功能障碍。谷氨酰胺是人体含量最丰富的条件必需氨基酸，为淋巴细胞、单核巨噬细胞的分化增殖提供足够的能源物质，可改善患者淋巴细胞和单核巨噬细胞生成数量以及单核巨噬细胞系统的识别、吞噬和杀菌功能，并促进机体内抗炎症细胞因子(如肿瘤坏死因子、白细胞介素)的合成等，从而改善患者的免疫功能[5]。正常人体内存在很多重要的抗氧化物质(如谷胱甘肽)，具有保护机体多种蛋白质和酶的结构完整以及维持其正常生理功能的作用。谷氨酰胺是参与谷胱甘肽合成的重要物质。有研究证实，严重感染等所致的机体应激状态下，患者对谷氨酰胺需求量明显增加，谷氨酰胺摄入不足，使血液及组织内谷氨酰胺水平降低，机体谷氨酰胺池的水平越低，患者脓毒症危重程度和病死率越高，两者具有相关性[6]。此外，感染细菌和毒素的肠道黏膜细胞容易出现损伤、破坏，导致肠黏膜吸收和代谢功能减弱，肠道屏障功能破坏，造成细菌和毒素移位，引发内源性感染，使脓毒症患者病情加重，增加治疗难度[7]。谷氨酰胺是参与肠道黏膜细胞代谢的必需营养物质，可促进肠黏膜修复，维持肠道屏障功能稳定[8]。为了维护脓毒症患者(特别对于合并严重烧伤患者)肠道黏膜屏障的完整性、改善免疫状况、维持脏器功能等，适当添加谷氨酰胺的肠外营养液将有助于促进脓毒症患者的恢复[9]。但目前是否对所有脓毒症患者添加谷氨酰胺的肠外营养液仍存在争议。部分研究认为，添加谷氨酰胺的肠外营养液治疗的患者总病死率显著升高[10]。

1.2精氨酸 精氨酸作为重要的条件必需氨基酸，是机体鸟氨酸循环的重要组成部分，对维持机体氮平衡具有不可替代的作用。精氨酸对巨噬细胞的功能有重要影响，可以提高巨噬细胞的抗原呈递能力，改善免疫功能，刺激生长激素增加，产生一氧化氮和氨气，是体内多种小分子复合物的前体，可促进胶原纤维合成，加速伤口修复，具有免疫营养作用，对免疫功能和肿瘤生长具有双重调节作用[11-13]。脓毒症患者在应激高分解状态下，精氨酸利用率下降，进而使体内一氧化氮合酶减少，免疫功能紊乱加重。有研究发现，参与免疫应答的相关细胞(如淋巴细胞、单核巨噬细胞等)在脓毒症进展过程中出现明显的数量减少和功能减退，导致机体清除病原微生物的能力明显下降，甚至引发脓毒症患者的不良结局[14]。因此，给予脓毒症患者积极抗感染治疗的同时，针对免疫功能障碍的免疫调理治疗成为脓毒症患者综合治疗中必不可少的部分。但精氨酸补剂可能引发血管舒张和低血压[15]。有研究报道，脓毒症休克患者补充精氨酸不会造成血流动力学的不稳定，故可对脓毒症患者补充精氨酸治疗，但尚有待研究的进一步证实[16]。

1.3芳香族氨基酸和支链氨基酸 人体内凡含有芳香环的氨基酸都属于芳香族氨基酸，芳香族氨基酸主要包括苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸，支链氨基酸包括有亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸。脓毒症患者尤其合并肝功能损害和肝功能衰竭时，机体对芳香族氨基酸清除能力下降，血芳香族氨基酸水平升高，同时肌肉组织对支链氨基酸利用增加，导致血支链氨基酸水平降低，最终出现体内芳香族氨基酸与支链氨基酸比例失衡。支链氨基酸抑制芳香族氨基酸向脑内转运的作用减弱，使芳香族氨基酸大量进入脑组织。

由于脓毒症患者肝内酶系统受损不能正常解毒，苯丙氨酸、酪氨酸入脑，经β-羟化酶作用产生与儿茶酚胺递质(多巴胺、去甲肾上腺素)相似的结构，与儿茶酚胺递质竞争受体，但不能正常传导神经冲动的苯乙醇胺和羟苯乙醇胺等假神经递质，从而抑制正常神经递质的合成，干扰脑干网状结构的正常活动，导致机体出现神经精神症状和不同程度的意识障碍[17]。脓毒性脑病程度越重，患者意识障碍越明显，相应的血浆芳香族氨基酸水平越高，均在动物实验和临床研究得到证实[18-19]。由此可见，氨基酸水平的变化对脓毒性脑病的发生、进展和恶化起重要作用。已有研究发现，给予有神经系统异常症状脓毒症患者补充支链氨基酸治疗，可使患者血浆氨基酸恢复平衡，脑病症状减轻。对于脓毒症尤其是合并肝功能损害的患者，若将支链氨基酸作为补充肠外营养的能量来源，可改善患者脑功能，起到积极保护作用，并有助于改善临床结果和生存情况[20]。支链氨基酸通过参与胰岛素作用、蛋白质合成、线粒体生物发生、炎症和脂质代谢等信号通路，增强免疫细胞功能，帮助受损免疫系统恢复，改善脓毒症患者营养状况和临床结局[21]。

1.4瓜氨酸 瓜氨酸是一种非蛋白质α氨基酸，具有形成肽键的能力，不能通过蛋白质直接分解而生成。肠道是唯一能大量合成瓜氨酸的器官，谷氨酸在体内经过肝脏循环和肾脏近曲小管摄取后，与氨作用生成精氨酸和一氧化氮，从而发挥改善免疫功能、抗氧化、维护肺功能等重要的生理功能。在脓毒症尤其是脓毒性休克状态下，患者全身器官血供重新分布，胃肠道常处于低灌注、低氧供状态，体内大量炎症介质释放，极易出现肠道黏膜损伤和肠功能障碍，导致瓜氨酸合成明显减少[22]。Luiking等[23]的一项对健康人群、普通重症患者和脓毒性休克患者氨基酸代谢的对比研究发现，脓毒症患者尤其脓毒性休克患者的血浆瓜氨酸合成水平大幅度下降，与健康人群相比，至少下降56%以上。Hull等[24]对儿童肠功能衰竭进行深静脉置管后发生导管源性感染的研究发现，血浆瓜氨酸水平越高，导管源性感染发生率越低，由此得出，瓜氨酸水平可以作为判断发生导管相关性血流感染的独立影响因素。Piton等[25]对67例多器官功能衰竭患者的研究发现，24 h低血浆瓜氨酸水平与患者28 d死亡率有关。血浆瓜氨酸还可作为脓毒症急性肠功能障碍的诊断标志物[26]。通过补充瓜氨酸与直接补充精氨酸在非脓毒症人体和动物模型的药动学的对比研究发现，直接补充瓜氨酸可获得更高的血浆精氨酸水平，导致一氧化氮合成增加，可见，更多富含瓜氨酸的氨基酸制剂的出现将对脓毒症的治疗发挥更好的作用[27]。

1.5谷氨酸 谷氨酸是人体血浆和组织中含量最丰富的氨基酸，参与机体氮代谢，是器官和组织间氮转运的载体，体内多种细胞的代谢氧化燃料，参与细胞信息传递，是大多数神经细胞突触的兴奋性神经递质。脓毒症时，神经细胞受损，谷氨酸经细胞膜漏出增加，大量谷氨酸被释放到细胞外间隙，而细胞外高水平谷氨酸最终造成N-甲基-D-天冬氨酸受体数量和活性下调，正常神经元细胞N-甲基-D-天冬氨酸受体途径的信号传递反应受到影响，造成机体出现不同程度脑功能障碍。体外实验亦表明，细胞外高水平谷氨酸导致离子通道受损，Na+、Ca2+内流，过多水分进入细胞使神经细胞肿胀变性，细胞内Ca2+超载导致细胞坏死等一系列病理损害，这些都是脓毒性脑病的可能发病机制[28]。Koppel等[29]研究发现，危重患者细胞外谷氨酸水平越高，发生惊厥的可能性越大。Ytrebø等[30]对脓毒症合并急性肝功能障碍的动物实验发现，肝功能失调时，血浆谷氨酸水平出现相应下降，谷氨酸可作为脓毒症评价肝功能失调的指标之一。施东伟等[31]的研究发现，脓毒症急性肝功能障碍死亡组的血清谷氨酸水平显著下降，合并谷氨酸/谷氨酰胺比例下降。因此，监测血清谷氨酸水平降低情况以及谷氨酸/谷氨酰胺比例变化来评估脓毒症急性肝功能障碍患者的预后，对临床有较强的指导意义。

2 氨基酸检测方法

2.1高效液相色谱法 高效液相色谱法是临床对血液中氨基酸水平进行检测的常用方法，主要衍生方式有邻苯二甲醛法、异硫氰酸苯酯法、2,4-二硝基氟苯法等。邻苯二甲醛作为快速反应剂，先与带有仲氨基团的氨基酸反应，然后进行柱前或柱后的液相色谱法检测，此方法虽然反应速度快，但需要先将氨基酸初步分离，再进行衍生化处理，最后完成紫外线监测，因此干扰因素较多，处理步骤复杂，分析时间长，缺乏特异度，且无法进行某些微量氨基酸定量监测。目前发现几乎所有构成蛋白质的氨基酸都可分为D-型和L-型两类。某些微量的内源性D-型氨基酸(如D-天冬氨酸和D-谷氨酸等酸性氨基酸)存在于人体的体液和组织中，有重要的生理功能和疾病标志物作用，成为代谢组学和创新药物开发的研究热点[32]。需要特异性和敏感性更高的氨基酸分析方法实现相应的氨基酸代谢组学分析，二维手性高效液相色谱法是近年来改进的氨基酸液相色谱法，可以实现生物样品中D-型氨基酸分析[33]。

2.2氨基酸分析仪 氨基酸分析仪是目前临床和科研中较常用的一种氨基酸检测专用仪器，工作原理是典型的利用柱后衍生检测方法实现对氨基酸检测，仪器核心部件为离子交换柱，大多选用磺酸型阳离子树脂分离柱，离子交换柱首先对样本进行初步分离，然后通过设定的洗脱程序，用不同离子强度、pH值的缓冲液，按照首先酸性氨基酸，之后中性氨基酸，最后碱性氨基酸的洗脱顺序，将受检标本的氨基酸依次洗脱下来，将洗脱下来的氨基酸与茚三酮反应液在135 ℃的加热条件下进行反应，最终生成蓝紫色物质。氨基酸分析仪利用紫外检测器分别在570 nm、440 nm对产生的蓝紫色物质进行检测和外标法定量，从而实现对氨基酸的定量检测[34]。目前，我国应用的氨基酸分析仪有KLA-5型、835-50型、85000型和8000A型。利用氨基酸分析仪进行氨基酸检测的专一性比较强、灵敏度相对较高、操作方便，完成一次血氨基酸检测的时间较短，最短可缩至半小时左右，但采取柱后衍生检测的内外影响因素较多，洗脱程序导致检测需要时间也较长，故尚不能实现对临床高灵敏性和高特异性分析的大样本氨基酸进行检测。

2.3液相色谱-质谱/质谱联用 液相色谱-质谱/质谱联用法是近年来出现的氨基酸检测新方法，也是未来氨基酸检测技术的发展趋势，该方法不采用柱前或柱后衍生的传统检测方法，利用挥发性离子对试剂(如七氟丁酸/九氟戊酸等)实现氨基酸直接上机检测，可成功避免衍生过程繁多的影响因素，与传统液相色谱、氨基酸分析仪相比，具有更强的抗干扰能力，准确性、敏感性性和重现性更高，但液相色谱-质谱/质谱联用法成本较高，因此未能广泛开展。Zoppa等[35]采用高校液相色谱-电喷雾-质谱联用法技术对新生儿干燥血点氨基酸进行定量或定性分析，该方法不需要衍生化试剂的处理，可以快速实现(10 min内完成)40种氨基酸及同分异构体的分析。目前，临床也借助液相色谱-质谱/质谱联用技术实现了对氯氮平中毒患者的快速准确判定，并通过测定乙型肝炎病毒感染者血浆中抗乙型肝炎病毒核苷类似物(恩替卡韦、拉米夫定、替比夫定和替诺福韦)来指导乙型肝炎患者的临床治疗[36]。由此可见，液相色谱-质谱/质谱联用法可通过快速测定各种样品中的游离氨基酸，实现对药物等小分子化合物血药浓度的监测，为寻找临床诊断证据和指导调整药物剂量提供技术支持。

3 小 结

脓毒症患者机体代谢紊乱的机制复杂。目前，各种氨基酸的生理作用尚不完全明确，且不同氨基酸之间以及氨基酸、糖类、脂肪三大能量物质相互交错影响，需要进一步研究明确不同氨基酸的生理作用以及脓毒症不同阶段氨基酸的代谢水平变化等。不同氨基酸检测方法各有优劣，仍需进一步发掘更为准确、快速、全面和经济的氨基酸检测方法，以便早期准确地评估和治疗脓毒症患者，遵循个体化原则，补充更准确的营养物质，从而改善预后。