自噬在肺纤维化中的作用机制

欧文芳，刘 刚，王亚红，宋泽庆

(广东医科大学附属医院a.临床医学研究中心，b.呼吸内科，广东 湛江 524001)

肺纤维化是一种慢性、渐进性的肺间质性疾病，由持续的肺泡上皮细胞损伤和病理性损伤修复所致，可通过影响肺换气导致严重的肺功能障碍，从而引起致命性的后果。临床上，肺纤维化多表现为进行性呼吸困难伴有刺激性干咳，病情呈进行性发展，患者最终因呼吸衰竭而死亡。肺纤维化患者的中位生存时间一般为3年[1]。肺移植曾是提高其患者生存率的唯一方法，近年美国食品药品管理局批准了两种药物用于治疗特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)，分别为尼达尼布和吡非尼酮，但其确切作用机制尚未完全明确[1]。虽然已有病理学研究证实了部分参与发病进程的相关机制，但IPF的发病机制仍不清晰。随着研究的不断深入，发现自噬功能障碍在肺纤维化发生发展中起重要作用，其通过参与成纤维细胞活化、肌成纤维细胞分化和细胞外基质(extracellular matrix,ECM)沉积等途径促进肺纤维化，提示自噬可能是肺纤维化发病的重要机制之一[2]，而靶向调控自噬有望为肺纤维化的诊疗提供新靶点。现就自噬在肺纤维化中的研究进展予以综述，旨在阐明自噬在肺纤维化中的作用机制。

1 自 噬

自噬是细胞自身降解陈旧蛋白、细胞器，回收利用氨基酸、核酸等小分子以实现自身代谢需要和特定细胞器更新的过程。在哺乳动物细胞中，其信号调控主要通过依赖哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)和不依赖mTOR途径。其中，磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositide 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)/mTOR信号通路是调节细胞生长、增殖、运动和存活的核心途径[3]。研究发现，细胞在饥饿、缺氧、氧化应激、病原体感染、辐射和药物等应激情况下，自噬水平升高[4]。

自噬主要分为微自噬、巨自噬和伴侣介导的自噬3种类型，虽然三者在形态学上互不相同，但最终均是将内容物运送到溶酶体中进行降解和再循环，其中巨自噬的研究最为广泛。在生理条件下，巨自噬以低水平发生，其通过降解受损或多余的细胞器以维持细胞生长。在应激条件下，自噬被诱导活化并通过降解胞内代谢物促进物质合成或能量产生，从而保证细胞存活[4]。虽然巨自噬是一种细胞保护机制，但过度的自我降解是有害的。因此，自噬功能障碍与多种人类疾病有关，包括肺纤维化、神经变性、癌症、衰老等。

巨自噬又分为非特异性巨自噬和选择性巨自噬。在营养或能量匮乏的情况下，非特异性巨自噬可促进细胞存活，而选择性巨自噬具有高度特异性，在维持细胞稳态中起重要作用。线粒体自噬是一种对线粒体进行降解的选择性巨自噬，对细胞的稳态更新和特定细胞的发育、自我清除起重要作用[3]。其是一种针对线粒体更新，调节线粒体数量与细胞能量需求匹配，并清除受损和功能失调的线粒体的选择性和适应性反应。如在哺乳动物中，红细胞的成熟是通过线粒体自噬清除未成熟红细胞中的线粒体而实现[3]。目前，线粒体自噬主要有以下两种途径：①红细胞的成熟是通过BNIP3L(Bcl-2/E1B 19 kDa-interacting protein 3-like)-微管相关蛋白1轻链3(microtubules associated protein 1 light chain 3，LC3)相互作用识别自身线粒体而达到清除线粒体的目的；②在清除受损线粒体时，PARK(Parkin)2通过与线粒体膜上的PINK1(PTEN-induced putative kinase 1)结合，对线粒体外膜蛋白进行泛素化，使其与LC3相互作用的受体SQSTM1(sequestosome-1)/p62结合而达到清除线粒体的目的。虽然两种途径最终均与LC3相互作用导致线粒体降解[3]，但目前关于线粒体自噬的机制仍未完全清晰。无论是从代谢、活性氧类产生，还是线粒体DNA损伤累积方面，线粒体损伤均会导致细胞损伤和凋亡[5]。因此，线粒体自噬是维持细胞完整性和正常生理功能的重要过程。

2 自噬在肺纤维化中的作用

有学者发现，IPF患者的肺组织表现为p62和自噬体数目增加[2,6]，而在成纤维细胞灶内mTOR活性较高，LC3B的表达减少[7]，说明自噬参与了肺纤维化的发展。研究发现，用促纤维化因子白细胞介素-17处理肺上皮细胞可减少自噬相关重要基因的表达，包括Beclin1、自噬相关基因(autophagy related genes,Atg)14[8]。因此，自噬功能障碍被认为在肺纤维化发生发展中发挥了作用。

2.1调控ECM的沉积 肌成纤维细胞过度表达α平滑肌肌动蛋白并促进ECM沉积，进而导致肺纤维化。在IPF患者肺分离的成纤维细胞中，LC3B水平降低，磷酸化Akt和磷酸化mTOR增加[7]。研究发现，在肺成纤维细胞中，通过敲除LC3B和Atg5基因抑制自噬可以诱导肌成纤维细胞分化，并使α平滑肌肌动蛋白和Ⅰ型胶原蛋白表达增加，其与转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)诱导的纤维化效果一致[2]，说明抑制自噬的活化可诱导肌成纤维细胞分化，促进ECM沉积。Atg4b缺陷小鼠在博来霉素处理后炎症反应加剧，并导致肺组织广泛纤维化和胶原沉积[9]，提示自噬不足可诱导胶原沉积。Nho和Hergert[7]发现，肺纤维化中病理性肌成纤维细胞表型ECM的分泌能力更强。当正常成纤维细胞受到大量的胶原聚合刺激时，自噬被激活；然而，IPF患者肺中的肌成纤维细胞没有这种应激反应[7]。进一步研究发现，在IPF患者肺成纤维细胞中叉头框蛋白(forkhead box protein,FOX)O3a信使RNA和蛋白水平明显降低，而FOXO3a是蛋白激酶B的下游靶标且涉及自噬的转录激活，因此在胶原富集的过程中,FOXO3a的表达下调使LC3B信使RNA水平也明显降低[10]，表明通过抑制FOXO3a来抑制自噬可促进肺纤维化[11]。此外，雷帕霉素也可抑制肌成纤维细胞中α平滑肌肌动蛋白、纤连蛋白的表达[6]。可见，自噬可调控肺纤维化ECM沉积进程，但其在ECM沉积中的具体分子机制尚不明确，有待进一步研究。

2.2缓解肺上皮细胞功能障碍 上皮细胞是肺组织的重要屏障，既能分泌抗纤维化、抗炎介质[12]，也能分泌促纤维化因子，在肺纤维化的形成中起关键作用[13-14]。有假说认为，上皮细胞应激导致慢性或持续性肺损伤，进而促进纤维化[15]。因此，有关自噬在上皮细胞中的表现与纤维化的关系成为研究热点。在肺表面活性蛋白(SPC或SPA)基因突变或Hermansky-Pudlak综合征相关肺间质性疾病中，突变蛋白错误折叠后在上皮细胞内大量积累，可导致细胞应激和纤维化[16]。这种突变蛋白的过度表达导致自噬流阻滞，线粒体自噬减少，从而破坏胞内蛋白平衡，且携带这种突变蛋白的患者处理继发性肺损伤的能力会降低，故使得上皮细胞更容易受到损伤并发生纤维化。此外，在Hermansky-Pudlak综合征患者的上皮细胞及Hermansky-Pudlak综合征基因突变小鼠中也可以观察到自噬功能障碍。另有报道，A549细胞中的Hermansky-Pudlak1基因敲除导致LC3B减少和p62累积，而过表达LC3B能恢复自噬功能并减少p62的累积[17]。条件性敲除小鼠上皮细胞中的结节硬化复合物1基因，使得博来霉素诱导的小鼠更容易发生肺纤维化，而通过雷帕霉素活化自噬后，这种情况可以逆转[18]。故认为，自噬不足导致上皮细胞功能障碍继而促进肺纤维化，而激活自噬可增强上皮细胞修复能力，延缓肺纤维化。但自噬是如何调控并影响上皮细胞功能的分子机制仍不清楚，有待进一步研究探讨。

2.3参与上皮间质转化 上皮间质转化是一个上皮细胞表型转换分化为间质细胞的过程，这在肺纤维化的形成过程中起重要作用。在内皮细胞中，Atg7功能丧失导致TGF-β上调并促进内皮细胞间质转化，这种情况较博来霉素诱导的肺纤维化更严重[15]。研究发现，瘦素通过PI3K/Akt/mTOR途径抑制A549细胞的自噬，从而加速其上皮间质转化进程[19]。以上研究表明，抑制自噬活化能有效诱导上皮细胞分化，进而加速上皮间质转化过程。目前，大部分有关上皮间质转化的研究集中在肿瘤细胞，而相关研究表明肺纤维化的发生与肿瘤部分通路发生相似[20-23]，故有关上皮间质转化与肺纤维化的关系有待进一步探讨。

2.4减少细胞凋亡 据报道，在IPF中成纤维细胞和肌成纤维细胞具有高度的抗凋亡活性[24]。在IPF患者的肺成纤维细胞中，Beclin1的表达下调，而抗凋亡蛋白Bcl-2表达增加[20]。自噬相关基因Atg4b缺陷小鼠在用博来霉素处理7 d后，其肺泡和支气管上皮细胞凋亡增加[9]。同时在IPF患者肺成纤维细胞中也观察到，当mTOR通路持续激活时，其抗凋亡能力显著增强[25]，而当FOXO3a和LC3B的表达减少时，Ⅰ型胶原基质诱导的细胞凋亡减少[10]。恢复FOXO3a或LC3B的表达后，成纤维细胞对胶原基质诱导的细胞凋亡恢复敏感[10]。Nho和Hergert[7]发现，异常激活的人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因/Akt/mTOR信号通路可诱导肌成纤维细胞在胶原合成上发生自噬，从而使细胞存活。因此，自噬可通过mTOR通路减少成纤维细胞凋亡，从而增加其抗凋亡能力。目前，关于自噬如何参与凋亡的机制仍不明确，需进一步探讨。

2.5协同TGF-β1信号通路 TGF-β是肺纤维化的主要调节因子之一[26]，而许多自噬基因(Atg4c、Atg5、Atg7、Atg16l1、Atg16l2、氨基丁酸受体相关蛋白、PARK、PINK1、p62和泛素样激酶2)与TGF-β的调控相关[27]。TGF-β1通过调节肌成纤维细胞的分化和增殖，促进ECM沉积，其被认为是肺纤维化发展的关键因素之一[28]；同时，它可以抑制成纤维细胞中的自噬[27]。此外，TGF-β能诱导MRC-5细胞分化，并增加纤连蛋白、Ⅰ型胶原蛋白和α平滑肌肌动蛋白的表达，激活mTOR通路，减少LC3B和增加p62的表达[6]。Tubastatin可通过抑制TGF-β诱导的PI3K-Akt-低氧诱导因子-1α-血管内皮生长因子途径减少自噬发生，抑制胶原蛋白的沉积[29]。而敲减Beclin1或LC3使得TGF-β诱导的肌成纤维细胞分化增强，纤连蛋白和α平滑肌肌动蛋白蛋白表达水平上调更为明显[6]。相反，雷帕霉素能减弱TGF-β诱导的肌成纤维细胞分化[6]。干扰真核生物延伸因子2激酶表达后，mTOR信号通路被激活，TGF-β1对自噬的影响增强，LC3B蛋白减少，p62蛋白水平升高。而雷帕霉素可以逆转TGF-β对真核生物延伸因子2激酶缺陷的成纤维细胞作用[30]。沉默LC3和Atg5基因增加了α平滑肌肌动蛋白和Ⅰ型胶原蛋白的表达，且TGF-β处理能进一步升高它们的表达水平[2]。目前，关于TGF-β1介导的相关信号通路如何协同自噬参与肺纤维化发病的机制尚存在争议，需进一步探讨。

2.6介导内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS) ERS是肺纤维化发病的重要机制之一，能够有效诱导自噬激活。其主要通过PERK-eIF2α-ATF4-CHOP级联激活自噬基因转录，并通过IRE1-c-Jun氨基端激酶介导Bcl-2的磷酸化，使Beclin1与Bcl-2解离，从而活化Vps34促进自噬体形成[1,31]。Araya等[2]在人支气管上皮细胞中使用Torin1(mTORC1/2抑制剂)或沉默LC3或Atg5基因可加剧ERS，从而诱导细胞衰老。Bueno等[32]用衣霉素(ERS诱导剂)诱导A549细胞ERS，导致线粒体去极化和细胞凋亡；当使用巴弗洛霉素A1抑制自噬时加剧了线粒体去极化和细胞凋亡，说明自噬不足会加剧ERS破坏线粒体的稳态。在小鼠体内，通过气管内注射衣霉素或感染鼠疱疹病毒68(与EB病毒同源)可引起体内ERS和PINK1的表达下调，从而发生肺纤维化；但敲除PINK1小鼠肺中的p62表达增加，纤维化加重[32]。Bueno等[33]还发现随着年龄增加，持续的ERS会减少PINK1的表达，且在肺泡上皮细胞中ERS可诱导PINK1的转录抑制因子活化转录因子3的表达，从而抑制自噬。目前，关于ERS如何介导自噬调控肺纤维化的机制尚未完全清楚，需要进一步研究。

2.7调节血管紧张素(angiotensin，Ang) 肾素-Ang系统在肺纤维化的发病机制中发挥了重要作用[34-35]。肾素-Ang系统包括血管紧张素转换酶/AngⅡ/AngⅡ-1型受体和血管紧张素转换酶2/Ang-(1～7)/Max两大轴系。AngⅡ通过其特异性受体AngⅡ-1型受体参与肺部多种疾病的发生发展，而Ang-(1～7)通过作用于其特异性受体Max发挥对AngⅡ的拮抗作用。AngⅡ在肺纤维化中是诱导胶原合成、自噬发生和胶原降解的关键因子。Meng等[36]发现，自噬通过氧化还原调节AngⅡ引起的活性氧增加和核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3炎症小体激活过程，从而减轻肺纤维化。而Ang-(1～7)可减弱活性氧引起自噬受损，改善与吸烟相关的肺纤维化[37]。此外，过表达血管紧张素转换酶2可以增强自噬，改善肺部胶原的沉积[38]。目前，关于Ang如何协调自噬参与IPF发生、发展的报道甚少，有待进一步研究。

2.8指导肺纤维化的临床用药 在临床用药中，美国食品药品管理局批准了两种用于治疗IPF的药物，分别是吡非尼酮和尼达尼布。已有报道，敲减Atg5和Atg7基因明显抑制了吡非尼酮诱导的自噬，表明吡非尼酮可以激活经典的自噬途径[39]。PARK2介导的线粒体自噬在肺纤维化中起调节肌成纤维细胞分化的作用[40]，吡非尼酮可通过PARK2促进LC3的转化诱导自噬，从而调节肌成纤维细胞分化。但是，吡非尼酮的抗纤维化功能主要通过抗氧化作用实现，敲除PARK2基因可使血小板衍生生长因子受体-PI3K-Akt信号转导衰减，而吡非尼酮抗氧化活性并不完全依赖于PARK2介导的线粒体自噬，故证明吡非尼酮可部分通过自噬激活参与肺纤维化进程[39]。而尼达尼布可以激活非经典自噬途径，下调IPF中成纤维细胞的ECM生成能力，减少纤维连接蛋白和Ⅰ型胶原蛋白的表达，并抑制原代人成纤维细胞中TGF-β相关通路的激活[41]。因此，治疗肺纤维化药物的作用机制与自噬密切相关，它们通过促进自噬改善肺纤维化。

3 小 结

目前，虽然有不少获批上市的治疗肺纤维化药物，但其确切作用机制仍不完全清楚，因此亟须阐明新的IPF发病机制和寻找更有效的药物靶点阻断肺纤维化的发生发展。自噬作为细胞的保护机制，不仅参与了氨基酸供应，还参与了各种细胞应激反应，对维持细胞稳态和清除有害物质起重要作用。随着研究的不断深入，目前大部分证据表明自噬缺陷广泛存在于ECM富集、肺上皮细胞功能障碍、凋亡、TGF-β信号刺激、ERS、Ang系统等促进肺纤维的发生发展的生物学活动中。因此，自噬有望为IPF的治疗提供新靶点和方向。但自噬如何调控其相关通路参与肺纤维化的作用仍存在争议，需进一步探讨。