外泌体与放射性肺损伤相关性的研究进展

张琨明，于倩倩，何环宇，莫文倩，林庆铿，陈 宏

(1.昆明医科大学研究生院，昆明 650031； 2.联勤保障部队第九二○医院肿瘤科，昆明 650032)

近年来，放疗已成为胸部肿瘤最重要的治疗方法之一。尽管通过先进的放射技术向肿瘤患者提供更多的局部剂量可以提高生存率和减少辐射相关毒性，但放射性肺损伤的发生仍是不可避免的。放射性肺损伤既限制了胸部放疗剂量的增加，导致肿瘤控制不佳，又影响接受放疗的肿瘤患者的生存率和生活质量。X线照射肺组织时，细胞受到辐射的直接或间接损伤,一旦辐射剂量超过辐射阈值，辐射损伤可能超出人体固有的修复能力，导致肺损伤[1]。研究人员一致认为电离辐射可引起上皮、内皮细胞的损伤和血液空气屏障功能障碍，增加血管通透性，电离辐射进一步杀伤肺泡巨噬细胞，上调转化生长因子-β1(transforming grow factor-β1，TGF-β1)，肿瘤坏死因子、白细胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6/IL-12，激起体内炎症和免疫反应而导致肺损伤[1]。外泌体是直径20～200 nm的膜囊泡[2]，在体内介导细胞之间或组织之间的通信，作为运输小泡参与体内多种生理过程和疾病发生。目前外泌体在炎症和免疫方面有很多研究，但是参与放射性肺损伤的发病机制尚不清楚。现对外泌体参与放射性肺损伤发生机制进行综述，为放射性肺损伤的预防和治疗提供新思路。

1 外泌体

外泌体是细胞自主向胞外分泌的膜囊泡，其由蛋白质(转录因子、酶、热激蛋白等[3])、寡核苷酸(DNA、信使RNA、miRNAs和非编码RNA等[4])和代谢物(脂类、乳酸、谷氨酸等[5-6])组成。外泌体在细胞之间以及在不同组织之间形成一个遗传信息通信网络，可以通过让基因组片段在外泌体内的运输使遗传信息能够在单个细胞的边界之外传播[7]。外泌体由各种细胞分泌，如内皮细胞、平滑肌细胞和肿瘤细胞等，存在于人类体液中[8]。不同细胞或组织分泌的外泌体内含有的物质和功能不同，所以在组织中的作用也不同。此外，外泌体由于有各种各样的生物分子，影响和调节若干重要的生物功能，包括细胞生长、分化、免疫反应、激素激活和代谢等[9]。组织在氧化应激、缺氧、辐射及细胞损伤或炎症细胞活化期间，也会积极地产生外泌体。在多种疾病的发病机制和治疗、介入治疗和靶向治疗及肿瘤等疾病生物标志物的研究方面也具有新的潜力[3]。

2 放射性肺损伤

放射性肺损伤是胸部肿瘤放疗最常见的并发症，增加放疗剂量或增加照射肺体积，联合化疗可明显增加放射性肺损伤的风险[9]。放射性肺损伤以低氧血症、非心源性肺水肿、肺低顺应性和广泛的毛细血管渗透为特点[10]，早期表现为渗出性炎症，暴露后6～12周并发间质性肺炎，晚期以慢性炎症、组织重塑和肺纤维化为特征[11]。

细胞因子在放射性肺损伤的发生发展中有重要作用。放疗后许多细胞因子在肺部表达，促进炎症细胞的活化、聚集导致急性放射性肺炎的发生。放射性肺损伤涉及两种细胞因子：第一种为肿瘤坏死因子-α、IL-1、IL-6和单核细胞趋化肽，第二种为TGF-β1和成纤维细胞生长因子，第一种因子负责炎症介导的反应，第二种因子可促进成纤维细胞的增殖和分化，调节细胞外基质的代谢[12]。IL-6可通过促进炎症和纤维化导致小鼠的过敏性肺炎[12]。TGF-β1是发生纤维化的标志产物，可通过TGF-β信号通路(主要有Smad依赖和非依赖两种)引起炎症和纤维化反应[13]。肿瘤坏死因子-α在放射性肺损伤中参与炎症反应的诱导和放大，而成纤维细胞通过胶原和其他细胞外基质蛋白的产生在纤维过程中发挥关键作用[11]。

电离辐射可以直接产生活性氧，活性氧一方面直接攻击细胞和组织的生物膜，刺激成纤维细胞增殖和胶原形成，导致肺组织变性和坏死。另一方面，活性氧通过细胞内信号转导和基因表达介导肺细胞凋亡，对蛋白质、核酸、脂质等生物大分子造成直接的DNA损伤，并对组织和细胞造成损伤[14]。辐射引起的远期效应部分是由慢性氧化应激和炎症引起的，导致脂质过氧化、DNA和蛋白质的氧化以及促炎症细胞因子的激活[15]。超氧阴离子自由基和羟基自由基等自由基的形成是放疗不可避免的结果,这些自由基激活TGF-β1，促进上皮细胞凋亡[10]。

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)家族在放射性肺损伤中扮演重要角色，可以降低细胞外基质的所有种类蛋白[12]，MMP-9可以减少肺内皮细胞基膜，导致肺上皮和血管内皮细胞损伤，降解细胞外基质，加重肺损伤[13]。Selman等[16]研究发现特发性肺纤维化患者体内MMP-2和MMP-9过表达导致肺纤维化。有研究表明蛋白激酶B信号通路在促进MMP-2和MMP-9表达中起重要作用[12]。

3 外泌体与放射性肺损伤

3.1免疫机制 免疫紊乱是放射性肺纤维化的驱动力[17]。研究者一致认为，电离辐射可引起上皮细胞和内膜细胞的损伤，血气屏障功能障碍，增加血管通透性，电离辐射可以进一步激活肺泡巨噬细胞，上调TGF-β1、肿瘤坏死因子-α、IL-1β、IL-6、IL-12(尤其是关键因子TGF-β1)[18]。人体的免疫反应可以放大这一过程，增加局部炎症反应，引起间质性肺炎的发展，慢性炎症的持续性最终导致肺纤维化[19]。巨噬细胞和成纤维细胞被ILs、TGF、肿瘤坏死因子、血小板源性生长因子诱导活化，巨噬细胞分泌ILs和肿瘤坏死因子-α，肿瘤坏死因子-α通过诱导细胞间黏附分子的表达和前列腺素及其他炎症介质的产生来介导放射性肺炎和纤维化的产生[20]。Moon等[21]研究证明肺上皮细胞衍生的外泌体传递胱天蛋白酶3(一种促凋亡因子)，通过Rho相关的coiled-coil激酶Ⅰ激活巨噬细胞，这成为肺上皮细胞衍生的外泌体从血液中消失可以减轻体内肺损伤的机制。同样，肺巨噬细胞衍生的外泌体释放IL-36γ(一种促炎细胞因子)，可能会引起细菌性肺损伤。在治疗肺炎中可以通过直接阻断外泌体为基础的巨噬细胞-上皮旁分泌间的“对话”来减轻炎症[4]。

癌蛋白MYC诱导在乳腺癌细胞分泌的外泌体中的miR-105，miR-105反过来激活在癌相关成纤维细胞的MYC信号去诱导代谢过程[22]，MYC在调节肿瘤微环境，特别是肿瘤基质的炎症和免疫成分方面有重要作用[23]。用Western Blot发现照射20周后的小鼠进行C-MYC分析示照射组C-MYC较对照组升高,且应用辐射防护剂后C-MYC降低[24]。可以推测C-MYC可能与放射性肺炎相关，而癌细胞外泌体分泌出的miR-105诱导了C-MYC升高的发生。

研究者发现间充质干细胞外泌体可以使人外周血单核细胞中的IL-10和TGF-β1增多，促进T淋巴细胞的增殖和免疫抑制能力。抗原呈递细胞是MSC外泌体介导的可能机制。骨髓间充质干细胞可通过上调T淋巴细胞的增殖和免疫抑制能力以减轻哮喘气道炎症[25]。T淋巴细胞能促进上皮间充质转化加速放射性肺纤维化的发生，β联蛋白作用是发生的可能机制[26]。还有研究在MSC外泌体内检测到200多种免疫活性蛋白[27]。创伤/失血性休克诱导巨噬细胞活化及促炎细胞因子的产生。体内实验表明，创伤/失血性休克后而非休克前产生的外泌体，可引起肺内炎性细胞的聚集，增加血管通透性，并诱发幼鼠的急性肺损伤[28]。所以以上可以证明外泌体在体内外具有激活免疫细胞的潜力，而免疫细胞通过分泌多种抗炎因子来减轻炎症反应，可以推测在放射性肺炎的产生机制中，外泌体有一定的抗炎和免疫调节作用。

3.2氧化应激 DNA在放射急性期的直接损伤和间接的氧化应激可引起细胞凋亡[29]。在氧化应激下小鼠肥大细胞释放的外泌体可以传递保护信号，这种保护信号是通过使受体细胞对氧化应激产生抵抗力来影响其他细胞对氧化应激的反应，从而保护受体细胞，增加应对氧化应激的能力，减少细胞凋亡[30]。外泌体释放的RNA可能就是外泌体在氧化应激中传递的保护信息。

研究发现心肌再灌注损伤的主要特征是腺苷三磷酸/烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的丢失、氧化应激的增加和细胞凋亡。间充质干细胞外泌体可增加心肌缺血再灌注损伤后ATP水平，减少氧化应激，激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B通路，增强心肌活力，防止心肌不良重构[31]。还有研究发现鼻内注射间充质干细胞衍生的外泌体可减少小鼠慢性乙醇摄入导致的大脑氧化应激和神经炎症[32]。骨髓间充质干细胞衍生外泌体显著降低了氧化应激损伤后细胞凋亡率和抑制活性氧的产生，而miR-214是主要效应分子[33]。低氧可显著上调慢性肾脏病患者miR-214-3p的表达，miR-214-3p基因敲除逆转上皮间充质转化减轻单侧输尿管梗阻小鼠肾纤维化，而过表达miR-214-3p促进了缺氧下肾小管上皮细胞的上皮间充质转化表型和纤维化因子的表达[34]。所以外泌体可以减少氧化应激和细胞凋亡，外泌体通过释放miR-214可以减轻细胞的氧化应激损伤，但是过表达miR-214反而促进纤维化。

3.3纤维化相关基因上皮钙黏素 上皮钙黏素是纤维化相关基因，缺氧诱导Twist/miR-214/上皮钙黏素轴的激活，加速肾纤维化[34]。上皮钙黏素可以从外泌体内被切割并以可溶性形式释放出来，上皮钙黏素产生的蛋白质se-cad存在于卵巢癌细胞分泌的外泌体中，研究表明se-cad能介导血管通透性[35]。放射性肺炎是一种渗出性炎性改变，如炎性细胞浸润或蛋白性物质渗出等。放射性肺纤维化始于肺泡毛细血管屏障破坏和愈合异常[26]，这可能与上皮钙黏素编码的蛋白质se-cad介导血管通透性有关。se-cad阳性外泌体可激活核因子κB信号级联反应[35]，免疫反应和炎症反应均与核因子κB通路相关[36]。核因子κB可以抑制miR-29b的表达，特发性和博来霉素诱导的肺间质纤维化的研究证实，miR-29表达较正常肺上皮明显降低，下调miR-29促进胶原蛋白和层粘连蛋白的产生和沉积[36]，所以se-cad阳性外泌体可以通过激活核因子κB抑制miR-29b的表达来促进肺纤维化。

3.4RNA 在博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化模型中，血清外泌体的miR-21-5p在急性炎症期和纤维化后期均显著升高，同样特发性肺纤维化患者外周血外泌体miR-21-5p表达也增加[2]。Fujita等[37]研究发现香烟烟雾提取物诱导的人支气管上皮细胞衍生的细胞外囊泡miR-210在肺纤维化中促进了肌成纤维细胞的分化。在巨噬细胞活化过程中miR-155和miR-146a的表达参与了炎症反应和内毒素耐受的调控[38]。内源性miR-155和miR-146a是调节炎症反应的两种关键miRNA，其中外泌体介导的miR-155增强，miR-146a降低炎症的发生。研究还发现miR-155、miR-146a存在于外泌体以及免疫细胞之间，并证明miR-146a能抑制而miR-155促进内毒素诱导的小鼠炎症反应[39]。所以可以推断外泌体中的RNA与放射性肺炎或纤维化过程有一定的相关性。

研究表明哮喘患者痰中存在外泌体而且外泌体内含有RNA[40]。特发性肺纤维化患者痰液外泌体中miR-142-3p与肺功能负相关，也是疾病的潜在参与者[41]。miRNAs：let-7d，miR-26a-5p，miR-29b-3p和miR-423-3p参与了炎症性疾病的发展，尤其在特发性肺纤维化的发生发展过程中起重要作用，如细胞外基质的沉积、胶原的分泌和上皮向间充质的转化等。研究表明miR-33a-5p还与肝纤维化有关[41]。虽然放射性肺损伤患者痰液外泌体是否成为衡量严重程度的指标和是否参与了放射性肺纤维化还有待进一步研究，但是为研究放射性肺损伤严重程度指标和发生机制提供了新的方向。

3.5细胞因子和酶 放射性肺炎涉及促炎细胞因子的产生，导致炎性免疫细胞浸润和破坏肺实质、基质和上皮细胞。此外，已知放射性肺炎发展为放射性肺纤维化，其特征是成纤维细胞增殖、胶原累积和破坏正常的肺结构[42]。①IL和TGF-β：一种新的IL-1模型涉及嘌呤能离子通道型受体7诱导的多泡体的形成，其中包含包裹IL-1β的外泌体，触发IL-1β和主要组织相容性复合体Ⅱ共同释放是炎症聚集和半胱天冬酶1激活的常见和绝对必要条件[43]。IL-1β在胸部照射后显著升高，在体内外均可触发促纤维化TGF-β的产生，提示IL-1在放射性肺损伤的发生发展中起重要作用，下调IL-1可以维持炎症因子的稳态来改善放射性肺损伤[44]。TGF-β1是诱导上皮-间充质转化的必要细胞因子，可促进肺上皮细胞的上皮-间充质转化，在肺纤维化中起重要作用[19]。另一项研究示间充质干细胞外泌体可升高人外周血单核细胞中的IL-10和转化生长因子[25]，高IL-10水平抑制炎症反应，如中性粒细胞滚动、黏附和跨膜迁移在炎症宿主中的变化，可减轻急性肺损伤[45]。②肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)：在靶向治疗中，外泌体能够在体内转移HGF的小分子干扰RNA，降低肿瘤和血管的生长速率[46]。Zhang等[47]证明基于间充质干细胞的HGF基因治疗不仅可以减轻炎症反应，而且可以抑制放射性肺纤维化的发展。HGF是刺激血管生成、抑制纤维化、减少凋亡的多功能因子[48]，在细胞凋亡调控中起关键作用[49]。研究表明，HGF调节大鼠肺泡上皮细胞中TGF-β1诱导的肌成纤维细胞标志物,如α平滑肌肌动蛋白、胶原1和纤维连接蛋白的表达。HGF影响TGF-β1信号抑制剂Smad7的表达[50]，从而减轻纤维化产生。③超氧化物歧化酶：研究证实心脏特异性高表达热激蛋白20的转基因小鼠，小鼠心肌细胞衍生的外泌体包裹更高水平的热激蛋白20、p-Akt蛋白、存活蛋白和超氧化物歧化酶1[51]，超氧化物歧化酶1可以减轻辐射诱导的肺内皮细胞损伤和功能障碍[1]。④MMP：在放射性肺损伤早期，MMP的表达和活性显著增加。MMP的合成抑制剂Ilomastat预处理可降低MMP的表达和活性，明显减轻受照小鼠的肺炎症和纤维化，提高受照小鼠的存活率[51]。MMP可以通过从细胞表面内化，再循环到质膜，然后参与小泡的生物发生，一部分被外泌体包裹，重新定向到胞外分泌[52]。

4 小 结

外泌体在体内介导细胞之间或组织之间的通信，作为运输小泡参与体内多种生理过程和疾病发生，目前在炎症和免疫等方面有很多研究，分泌物从RNA、蛋白质到细胞因子，对组织或细胞起的作用取决于分泌外泌体的细胞和组织的种类，同时又受多种刺激的影响，以及分泌时环境的影响。放射性肺损伤与免疫系统，炎性因子，以及RNA和酶，细胞通路都有一定的关系，而外泌体就成为参与这些活动的重要囊泡，随着外泌体被越来越多研究者所关注，研究者将会对外泌体有更深的了解，从而为放射性肺损伤机制研究和治疗、预防的探索提供新思路。