肝豆状核变性ATP7B基因突变的研究进展

黄 艳，刘志峰

(南京医科大学附属儿童医院消化科，南京 210008)

肝豆状核变性又称Wilson病，是一种以铜代谢障碍为特征的常染色体单基因隐性遗传疾病，病变主要累及肝脏、脑、肾脏和角膜等部位，引起进行性加重的肝硬化、基底节损害、肾脏损害及角膜色素环等[1]。肝豆状核变性由ATP7B基因突变引起，该基因编码铜转运P型ATP酶(copper-transporting P-type ATPase,ATP7B)。ATP7B是一种表达在多器官的膜蛋白，主要功能是促进铜随血液及胆汁排泄。当ATP7B基因发生突变时，ATP7B在细胞内的定位发生改变，其转运铜能力下降，引起血清铜蓝蛋白合成减少、胆管排铜受阻。过量的铜蓄积在体内，引起细胞坏死和器官损害，后期严重影响患者的生活质量，最终可引起死亡。目前，肝豆状核变性的诊断主要依靠典型的临床表现、实验室检查及基因检测，治疗包括青霉胺、锌制剂和肝移植等。早期诊断和早期干预对于延缓疾病的进展和预防不可逆的后遗症至关重要。目前，肝豆状核变性的全球患病率大约为1/3万，在隔离人群(如撒丁岛)中，患病率可达1/1万[2-3]，中国香港汉族患病率高达1/5 400[4]。目前对于ATP7B基因突变导致肝豆状核变性的具体分子机制尚不完全清楚。现就肝豆状核变性ATP7B基因突变的研究进展进行综述。

1 ATP7B分子结构、定位及铜运输功能

1.1ATP7B蛋白分子结构ATP7B基因位于第13号染色体长臂(13q14.3～q21.1)，全长约85 kb，包含21个外显子和20个内含子，编码一种由1 465个氨基酸组成的ATP7B。ATP7B属于跨膜蛋白，含6个N端金属结合域(N-terminal metal-binding domain,MBD)，每个金属结合域都含一段高度保守重复序列蛋氨酸-X-半胱氨酸-X-X-半胱氨酸，8个跨膜通道(transmembrane domain,TM-区)，1个ATP结合区(nucleotide-binding domain,N-区)，1个磷酸化区(phosphorylation domain,P-区)，1个磷酸酶区(phosphatase domain,A-区)[5-6]。MBD与铜有高亲和力，与抗氧化蛋白1(antioxidant-1,Atox-1)相互作用下接受来自细胞质的铜离子，并促进铜释放到跨膜孔道中[7]。MBD1～4主要调控其自身间的相互作用，MBD5～6是铜结合位点，能影响ATP7B蛋白的活性及催化能力[8]。半胱氨酸-脯氨酸-半胱氨酸序列位于第6跨膜通道，可选择性通过金属铜离子[6]。

如果ATP7B基因突变的残基是与ATP或铜的结合的关键位点，可能会引起ATP7B功能的完全丧失；如果突变只是影响对底物的亲和力、减缓构象转变或影响蛋白质的定位，ATP7B可能保留部分转运功能[9]。

1.2ATP7B定位及铜运输功能 ATP7B是一种高度表达在肝细胞反式高尔基体网络的跨膜蛋白。铜主要在十二指肠吸收，通过高亲和力铜转运蛋白1参与肝肠循环。到达肝细胞后，铜和金属分子伴侣Atox-1结合并形成复合物，然后与ATP7B以蛋白-蛋白的形式相互作用。铜在ATP7B作用下被转运至反式高尔基体网络，并与相关的酶结合，形成血清铜蓝蛋白，随血液代谢；当肝细胞内的铜离子水平升高至一定程度时，ATP7B从反式高尔基体网络转运至溶酶体，将过量的铜运输到囊泡，铜经胞吐作用随胆汁排泄[10]。在这一过程中，ATP7B借助ATP水解释放的能量磷酸化，随后脱磷酸化释放铜跨膜所需的能量。因此，ATP7B依赖性胆汁铜排泄是维持铜代谢平衡的主要方式。

2ATP7B基因突变类型及特点

肝豆状核变性ATP7B基因突变类型多样，目前人类基因突变数据库已收录780种ATP7B基因突变，包括491种错义/无义突变、65种剪切位点突变、187种小缺失/插入突变、12种大片段缺失。突变可能发生在基因的任何位置，包括外显子、内含子，甚至是启动子区域。

ATP7B基因突变在不同种族和地域中存在遗传异质性。欧洲人群最常见的突变类型是14号外显子上的H1069Q突变，在意大利、瑞典和罗马尼亚等地多见，等位基因频率为30%～70%[11-12]，临床主要以锥体外系症状为主，如震颤、肌张力障碍、精神症状等。亚洲人群最常见的突变类型是8号外显子上的错义突变R778L，以中国、韩国和日本最多见，其等位基因频率为17.3%～60%[4,13]，临床以肝脏方面症状为主，如肝功能异常、肝硬化、肝脾大等；其余常见的还有P992L、Q1399R等。

不同区域发生突变的概率不同。①MBD区(与1～6号外显子相关)：目前已报道位于该区的错义突变有18种，如位于MBD1的G85V，该突变抑制ATP7B与Atox-1的相互作用，影响蛋白和铜的结合[14]；②半胱氨酸-脯氨酸-半胱氨酸跨膜转运区(与7～10、12、13号外显子相关)：目前报道有103种突变，如R778L、G937S，该区突变主要通过改变蛋白的定位影响其功能[14]；③A-区(与11号外显子相关)：目前发现有22种突变，该区域突变可导致ATP7B超磷酸化，引起催化活性的丧失[14]；④P-区(与14～16号外显子相关)：有47种突变，如I1148T；⑤N-区(与17～18号外显子相关)：有超过55种突变，该区突变和P-区一起影响蛋白和ATP的结合，造成功能缺失[14-15]。但即使突变替换的氨基酸发生在同一区域，其编码的蛋白功能改变也不完全相同。

3ATP7B基因突变的致病机制

目前，ATP7B基因突变功能研究以错义突变为主，突变主要通过影响蛋白的合成、折叠、定位及降解等过程引起ATP7B蛋白转运功能的减弱或缺失，最终引起铜的沉积。ATP7B基因突变可抑制法尼酯X受体/短异二聚体伴侣通路，引起胆汁酸生成增加，肝功能受损，导致胆汁淤积。铜代谢的主要途径是胆汁，发生胆汁淤积时，进一步影响铜的代谢，从而引起恶性循环[16]。

3.1ATP7B基因突变影响mRNA转录 前体mRNA的选择性剪接是真核生物增加蛋白质多样性的重要手段，对于基因表达非常重要，包括5′和3′端剪接等。剪接受顺式作用元件和反式作用因子的调控，如剪接增强子、沉默子等。ATP7B基因中大约有10%的致病突变发生在外显子和内含子连接处的保守剪接位点。研究发现，肝豆状核变性患儿携带ATP7B基因错义突变R919G，该突变位于外显子剪接调控元件区，引起外显子跳跃及氨基酸改变[17]。体内外实验表明R919G出现外显子跳跃，引起剪接增强子破坏、沉默子出现，从而影响外显子12的剪接，引起蛋白功能的缺失[17]。因此，ATP7B基因点突变可能引起严重的mRNA异常剪接，而不是对编码潜能的直接影响。

c.1707+5G>A突变位于5′剪接位点，影响前体mRNA的剪接。Liu等[18]利用剪接异常体外功能验证实验(minigene技术)对该突变进行分析，发现c.1707+5G>A转录产物出现外显子4缺失，其扩增长度为293 bp，较野生型的457 bp明显缩短；其mRNA表达水平较野生型明显下降。外显子4跳跃引起终止密码子提前出现，导致ATP7B蛋白合成提前终止，铜离子通道失活。无义介导的mRNA降解途径是真核细胞中重要的RNA监控机制，可识别并降解开放阅读框中含有提前终止密码子的mRNA，消除异常的剪接形式，避免因截短的蛋白产物积累对细胞造成毒害。

3.2ATP7B基因突变导致ATP7B蛋白结构改变 S653Y突变位点位于一段高度保守区域：G621-S668，在MBD6和TM1之间。该突变不会影响蛋白的定位及其折叠结构，能正常运输铜至反式高尔基体网络，不影响血清铜蓝蛋白的形成；但当细胞内的铜水平升高至一定阈值时，ATP7B仍位于高尔基体内，无法携铜转运至细胞膜。Braiterman等[19]研究发现S653Y突变引起跨膜段TM1内的局部变形，导致跨膜区TM1和TM2的相互作用改变，从而影响ATP7B从反式高尔基体网络转运至溶酶体的过程。

突变位点在MBD4的G386V和G386D，与野生型相比，其蛋白结构的热稳定性降低、活动性增强。在10 ℃以下时，大部分MBD4突变体蛋白很稳定，即能正确折叠并且能结合铜，但G386V和G386D不能得到有效折叠。二级结构分析显示：G386V蛋白丧失部分α-螺旋，β-折叠含量增多；而G386D突变蛋白失去β-折叠结构。与野生型相比，这两种突变蛋白的结构对称性增强[20]。热稳定性研究表明，这两种突变蛋白去折叠的热温度中点在40～50 ℃，较野生型的75 ℃明显下降，提示其蛋白稳定性降低[20]。MBD结构的不稳定性直接或间接影响ATP7B各结构域的相互联系，进而影响ATP7B和Atox-1的作用，增加与COMMD-1的相互作用[20]。COMMD-1是一个负性调节蛋白稳定性的因子，可以诱导ATP7B的降解及降低铜转运活性。

3.3ATP7B基因突变引起ATP7B蛋白定位异常及表达量减少 ATP7B是定位于反式高尔基体的膜蛋白，主要利用水解ATP释放的能量，将铜排出体外，维持体内铜离子的平衡；突变型ATP7B可滞留在内质网，无法携铜转运，引起铜在肝脏、脑等部位沉积。Huster等[9]对25种突变型ATP7B蛋白的铜转运功能进行研究，发现其中大部分突变蛋白的铜转运速率降低、承载铜离子数量减少；其中有16种突变蛋白的铜转运能力仅有野生型的5%～10%，甚至更低，包括D1027A、H1069Q、P840L等；有8种突变保留部分转运能力，如位于A-区的A874V、I857T；而只有M645R突变表现出铜过载现象。研究者将野生型及突变型ATP7B基因质粒转染至HEK293T和Sf9细胞，利用免疫荧光技术检测ATP7B蛋白在细胞中的定位，结果显示R969Q(突变位点在MBD区)蛋白定位在反式高尔基体网络，与野生型一致；L1083F(突变位点在N-区)和A874V(突变位点在A-区)蛋白定位于内质网，定位改变；这三者突变型蛋白表达量较野生型均有明显减少。Guttmann等[21]对L168P和S1423N研究发现前者蛋白表达量为野生型的(34.3±8)%，后者为(66.0±8)%。转运实验表明，L168P呈现出铜依赖性，S1423N则对铜水平升高无任何反应。ATP7B突变蛋白的错误定位及表达量减少均可导致其转运铜能力下降。

3.4ATP7B基因突变加快ATP7B蛋白的降解 由p38和c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)介导的促分裂原活化的蛋白激酶信号通路可影响蛋白的稳定性(如囊性纤维化跨膜转导调节因子[22])及调节内质网相关蛋白降解途径。内质网相关蛋白降解途径可保证正确折叠的蛋白质输出，对错误折叠的蛋白质进行鉴别、分类和降解，以此清除细胞内无功能的蛋白。Chesi等[23]研究发现，在过表达H1069Q突变的细胞中，p38和JNK表达明显升高。被激活的促分裂原活化的蛋白激酶信号通路诱导错误折叠的H1069Q蛋白滞留在内质网，并且通过内质网相关蛋白降解途径加快了突变蛋白的降解速度；同时由于细胞内铜离子的蓄积，活性氧离子水平增加，进一步影响内质网的稳态环境，形成恶性循环。上述研究结果提示，p38和JNK抑制剂可以通过对转录因子的调节，纠正H1069Q、D765N、L776V和R778L突变型蛋白的错误定位，提高ATP7B蛋白在反式高尔基体网络的表达及其转运能力；减少蛋白的降解，促进铜的代谢，降低细胞内铜离子的水平；但对于A874V和L1083F突变没有明显纠正作用。

3.5分子伴侣类药物可纠正突变型ATP7B蛋白的错误折叠 α晶状体蛋白B链(α-crystallin B chain,CRYAB)是胞质分子伴侣，属于小热激蛋白类，可以与跨膜蛋白结合，抑制多聚体复合物的形成，促进突变型蛋白正确折叠。研究显示，CRYAB可以与ATP7B-H1069Q在内质网处相互作用，抑制突变蛋白中大段寡聚合物的形成[24]。免疫荧光结果提示，在与CRYAB共转染下，超过60%的H1069Q蛋白恢复其正常定位。当细胞内铜水平升高时，CRYAB可以促进H1069Q重新分布于高尔基体囊泡，但对于H1069Q蛋白携铜排出体外的能力无明显提高。

姜黄素是一种内质网的钙离子ATP酶抑制剂，对膜定位有纠正作用。4-苯丁酸钠可以通过帮助突变蛋白正确折叠，利用泛素-蛋白酶体途径降解错误折叠蛋白，减少蛋白质在内质网的沉积，并且通过稳定蛋白构象促进突变蛋白的转运。van den Berghe等[25]报道，在30 ℃环境下或使用4-苯丁酸钠和姜黄素干预，G85V、R778L和H1069Q等突变型蛋白的错误折叠可被部分纠正，引起膜蛋白表达增加，并随药物浓度升高而升高，其异常定位可被纠正。

4 小 结

肝豆状核变性是一种常染色体隐性遗传疾病，临床表现多样，受基因、年龄、饮食、脂质代谢、种族等多种因素影响，给疾病的诊断和治疗增加难度。ATP7B基因突变引起编码蛋白错误折叠，导致ATP7B滞留在内质网、其催化及转运活性功能减弱或丧失，引起铜离子在肝脏、脑等部位沉积。关于铜介导的组织损伤机制目前仍不完全清晰。过量的铜蓄积在组织内可能会引起一系列氧化应激反应，破坏线粒体的结构和完整性，导致细胞损伤及凋亡。铜诱导的活性氧类水平增加和脂质过氧化均可造成线粒体的损失[26]。同时，铜离子的积聚会引起肝细胞内锌的重新分布而损伤肝细胞[27]。

目前，肝豆状核变性的治疗包括药物治疗、手术治疗、基因和细胞治疗、康复治疗等。在我国，由于D-青霉胺经济有效，是治疗肝豆状核变性的经典药物之一；但是对于有严重神经系统症状，特别是伴有肌肉僵硬的患者D-青霉胺不宜被使用[28-29]。研究显示，某些分子伴侣类药物(如4-苯丁酸)及p38和JNK抑制剂可以纠正突变蛋白的错误定位，恢复蛋白的转运功能；小分子物质DPM-1001能有效降低肝豆状核变性小鼠模型中肝脏及脑部的铜水平[30]。个体化的细胞和(或)基因治疗是目前的研究热点，其根本目的是恢复ATP7B介导的肝胆管排泄铜的功能[31]，可能是未来最有前景的治疗方法。