线粒体DNA突变与珠蛋白生成障碍性贫血相关性的研究进展

李春洪，欧明林，陈洁晶，眭维国，汤冬娥，戴 勇,※，薛 雯※

(1.广西师范大学生命科学学院，广西 桂林 541006； 2.解放军联勤保障部队第九二四医院肾脏科 全军器官移植与透析治疗中心广西代谢性疾病研究重点实验室，广西 桂林 541002； 3.暨南大学第二临床医学院(深圳市人民医院)临床医学研究中心，广东 深圳 518020)

珠蛋白生成障碍性贫血原名地中海贫血,又称海洋性贫血，是我国常见的常染色体隐性遗传病，以球蛋白链合成障碍为主要特征，主要分布在我国广东、广西壮族自治区、贵州、云南等地，其中广西壮族自治区和广东的基因携带率分别达24.13%和11.07%[1-2]。据世界卫生组织统计，全球约有3.5亿珠蛋白生成障碍性贫血基因携带者，其中α-珠蛋白生成障碍性贫血基因携带者2.6亿，β-珠蛋白生成障碍性贫血基因携带者8 000万～9 000万，每年出生约56 000例重型珠蛋白生成障碍性贫血患儿[3]。患者及家属对珠蛋白生成障碍性贫血认识匮乏，防控难度大，生育重症珠蛋白生成障碍性贫血患儿的风险高，也有医务工作者生育珠蛋白生成障碍性贫血患儿，可见重型珠蛋白生成障碍性贫血和中间型珠蛋白生成障碍性贫血是世界公认的公共卫生问题。珠蛋白生成障碍性贫血患儿常伴有生长发育不良而死于充血性心力衰竭[4]。目前，尚无有效的治疗珠蛋白生成障碍性贫血的方法，产前诊断是预防该病患儿出生的唯一方法。线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)基因突变与珠蛋白生成障碍性贫血的关系是研究的热点。线粒体损伤会直接导致呼吸链受损，从而导致多种疾病的发生[5-8]。珠蛋白生成障碍性贫血遗传学的研究主要集中在核基因方面，mtDNA突变可能参与珠蛋白生成障碍性贫血的发生、发展，但具体机制尚不清楚。现对mtDNA突变与珠蛋白生成障碍性贫血发病的关系及其机制予以综述。

1 mtDNA基因

1.1mtDNA的结构特征 线粒体是动态细胞器，由内外两层膜包被，常被称为“细胞发电站”，以氧化磷酸方式产生ATP，成为能源生产者[9]。线粒体控制多种代谢过程，如糖酵解、柠檬酸循环、电子传递链和氧化磷酸化、尿素循环和脂肪酸生物氧化等[10]。线粒体功能对细胞的能量平衡、代谢、信号传导和凋亡至关重要。人的mtDNA位于线粒体内，是一个长度16 569 bp的环状DNA分子，是独立于核DNA外的遗传物质，由编码氧化磷酸化所需的13种氧化磷酸作用酶亚基、合成蛋白与生成ATP必需的22种转移RNA (transfer RNA，tRNA)、2种核糖体RNA和1个D环组成[11]。mtDNA无内含子，D-loop区是唯一的非编码区，该区为mtDNA复制转录调控区，含有基因复制起点和负责转录调控的启动子区。D-loop区是mtDNA突变集中的区域，16024～16383和57～372核苷酸分别属第一高变区和第二高变区，分析这两个区域基因序列可用于调查人类起源和疾病的诊断[12]。mtDNA控制区是线粒体基因组的非编码区，又称控制区，富含A和T碱基，属于遗传变异性大、进化速度快的区域[13]。

1.2mtDNA基因的功能 mtDNA是一种结构简单稳定的核外遗传物质，在遗传多样性研究中广泛应用。所有mtDNA编码的多肽都参与线粒体能量的生成途径，如与呼吸链有关的为复合物Ⅰ～Ⅴ均排列在线粒体内膜内[14]。细胞中mtDNA的拷贝数比核DNA高，具有母系遗传、多拷贝、缺乏重组和高突变率的特点[15]。线粒体在ATP合成过程中产生大量活性氧类，可造成组织损伤，机制主要包括脂质过氧化、DNA损伤、蛋白质损伤、重要酶的氧化及促炎因子的释放。人mtDNA不受组蛋白保护，容易发生氧化损伤，且缺乏自我修复功能[14]。线粒体基因不含内含子，基因间间隔较小，甚至出现重叠基因，mtDNA在生殖细胞内分离时，分子间无交换和重组。mtDNA的突变率比核基因高出数个数量级，且在mtDNA非编码控制区域的两个高变量区域(HVRⅠ和HVRⅡ)中突变率更高[16]。mtDNA非常密集，是编码氧化磷酸化的关键因子，其突变母系遗传，可导致多种人类线粒体疾病，同时也与年龄相关疾病和衰老密切相关[17]。线粒体蛋白由mtDNA或核DNA编码，线粒体疾病可由两个基因组的突变引起[9]。mtDNA的高突变率导致其单核苷酸多态性非常丰富。许多线粒体基因突变可导致基因多态性，若生殖细胞发生突变，则遗传给子代。目前，已发现的线粒体单核苷酸多态性有1 321个，以转换和颠换突变为主，其中182个与疾病相关。线粒体单核苷酸多态性已成为诊断线粒体疾病的重要标志[18]。通过单核苷酸多态性与个体对药物敏感或耐受的相关性研究，可阐明遗传因素对药效的影响，据此建立与基因型相关的治疗方案，施行个性化用药。

2 mtDNA基因突变与疾病的关系

mtDNA突变可对寿命和器官功能产生负面影响。已知有250多种致病mtDNA突变，通常涉及神经性疾病，如目前研究较深入的阿尔茨海默病、帕金森病、2型糖尿病等[19-21]。mtDNA突变可导致严重的衰弱综合征或死亡，其严重程度取决于特定的基因突变以及每个细胞和组织中突变体与野生型mtDNA的比例，美国每年出生约778例受mtDNA突变影响的儿童[22]。对24～72岁成年人皮肤成纤维细胞、血液和诱导多能干细胞中mtDNA突变的研究发现，mtDNA缺陷的频率随着年龄的增长而增加，许多突变为非同义突变或存在于RNA编码基因中，可导致呼吸缺陷[23]。由于临床和遗传的异质性，线粒体疾病的流行难以确定，其表型谱自最初发现经典临床综合征与mtDNA重排和点突变有关以来有显著扩大。成人最低患病率超过1/5 000，多临床表型和核基因组的参与使线粒体疾病对临床医师来说具有挑战性[24-25]。

mtDNA缺陷是线粒体疾病的主要遗传原因，核DNA编码的线粒体相关基因缺陷也可导致线粒体疾病的遗传，已在mtDNA中发现了许多引起各种类型线粒体疾病的致病突变[26]。致病mtDNA突变通常具有异质性，由野生型和突变型mtDNA基因组共同组成，其异质水平与疾病严重程度相关[27]。最常见的致病突变是MTTL1基因(OMIM590050)中mtDNA的3243A→G突变(m.3243A→G)，编码tRNALeu(UUR)引起线粒体疾病和生理功能障碍，如线粒体脑病、乳酸症、脑卒中样发作和线粒体肌病等[28-29]。探究摩洛哥2型糖尿病患者的mtDNA变异和单倍群的相关性试验研究发现，疾病组中5种mtDNA突变体(C16187T、C16270T、T16172C、A16293G和C16320T)的流行性明显高于对照组，C16270T和C16320T变异与摩洛哥2型糖尿病患病风险增加密切相关[30]。在肿瘤发生方面，诱导活性氧类的特异性mtDNA突变增强了肺癌细胞向高转移潜能细胞的恶性转化。Mohamed Yusoff等[31]对49例脑肿瘤患者的肿瘤组织和血样进行基因突变分析，对D-loop区未被识别的新突变(176 A缺失，476C→A,566C→A和16405A缺失)进行分类，为马来西亚患者脑肿瘤中mtDNA的D-loop区域的改变提供了证据。D-loop启动子CpG岛特异性位点的去甲基化可能导致结直肠癌mtDNA拷贝数升高，引发细胞增殖增加、凋亡减少、G0/G1期相对细胞周期阻滞等生物学行为的改变[32]。有研究发现，mtDNA突变引起的线粒体功能障碍是多囊卵巢综合征的重要原因，线粒体tRNA突变与一组汉族家庭的代谢综合征和多囊卵巢综合征相关，其tRNALeu(UUR)C3275T、tRNAGlnT4363C和tRNALysA8343G突变应被视为其代谢综合征和多囊卵巢综合征进一步分子诊断的危险因素[33]。Wei等[34]对1 363例帕金森病、阿尔茨海默病、额颞叶痴呆-肌萎缩侧索硬化症、克雅病与正常对照脑组织进行全基因组测序发现，32.3%的受试者出现异常高频率的异质mtDNA变异，但并未发现任何罕见mtDNA或mtDNA异质性与疾病存在联系的证据；此外，观察到阿尔茨海默病和克雅病中mtDNA拷贝减少，可见mtDNA水平的变化在神经退行性疾病的发病机制中发挥作用，但mtDNA单核苷酸变异并不太可能在神经退行性疾病的发病机制中起主要作用，其mtDNA水平尚待进一步研究。

3 mtDNA基因突变与珠蛋白生成障碍性贫血发生发展的相关性

3.1α-珠蛋白生成障碍性贫血的分子机制 珠蛋白生成障碍性贫血是一种常染色体隐性遗传病，与至少一种珠蛋白基因突变/缺失导致功能性血红蛋白减少有关[35]。国内外科研工作者对珠蛋白生成障碍性贫血核基因缺陷和突变方面发病机制的研究比较深入。根据基因分型，临床上将珠蛋白生成障碍性贫血分为α型、β型、αβ型、γ型及δ型等，其中α型和β型高发。α-珠蛋白生成障碍性贫血是最常见的单基因疾病，主要由α-珠蛋白基因表达缺失或减少导致，其基因位于第16号染色体短臂13区3带(16p13.3)，每条染色体上均有两个α-珠蛋白基因，其排列顺序为5′-ε-Gγ-Aγ-ψβ-δ-β-3′，且HS-40是α-珠蛋白位点的主要调控元件[36]。根据α-珠蛋白基因簇的缺失，α-珠蛋白生成障碍性贫血可分为：①轻型，2个α位点缺失；②中间型，即血红蛋白H病，受影响个体产生的α-珠蛋白通常不到正常水平的30%，而β-珠蛋白相对过量；③重型，即Hb Bart胎儿水肿综合征，为4个α位点缺失,此类患者通常在子宫内或出生后不久死亡[37]。据统计，全球α-珠蛋白生成障碍性贫血携带者高达5.0%，其中1.7%有α-珠蛋白生成障碍性贫血症状，新生儿珠蛋白生成障碍性贫血的发病率约为 4.4/1万[38]。

3.2β-珠蛋白生成障碍性贫血的分子机制 β-珠蛋白生成障碍性贫血为单基因疾病，是全世界最普遍的常染色体隐性疾病，特点是功能性β-球蛋白链减少,α-肽链相对过剩并在红细胞膜上沉积，导致红细胞破坏，出现溶血性贫血,其失衡程度与疾病严重程度成正比[39]。β-珠蛋白生成障碍性贫血基因位于第11号染色体短臂1区2带(11p1.2)，每条染色体上只有一个β-珠蛋白基因，排列顺序为5′-ε-Gγ-Aγ-ψβ-δ-β-3′，且位点控制区是上游重要的调控区域[40]。α-球蛋白链和β-球蛋白链比例失衡和α肽链的不必要积累造成机械和氧化损伤，导致无效红细胞生成，与疾病严重程度直接相关。重型β-珠蛋白生成障碍性贫血是β-珠蛋白生成障碍性贫血的严重形式，其病理生理学以及随后定期输血导致铁超载，逐渐累及多个器官系统[41]。β-珠蛋白生成障碍性贫血的突变类型多为点突变，而β-珠蛋白基因外显子中只有少数缺失，如βCD54～58(-13 bp)和βCD89～93(-14 bp)。根据β-球蛋白链合成量降低程度，β-珠蛋白生成障碍性贫血突变可分为：①β0-珠蛋白生成障碍性贫血突变(β0/)，导致β-珠蛋白的缺失；②β+-珠蛋白生成障碍性贫血突变(β+/)，导致β-珠蛋白产量严重减少；β++-珠蛋白生成障碍性贫血突变(β++/)，导致β-珠蛋白的产量轻微减少[40]。目前，β-珠蛋白生成障碍性贫血突变至少有200种，中国人至少有34种。世界范围内，贫血导致的疾病负担在很大程度上成为很多疾病发病率和死亡率升高的原因[42]。组织缺氧，心脏病发病是β-珠蛋白生成障碍性贫血病死率升高的主要原因。临床上，珠蛋白生成障碍性贫血患者表现为慢性进行性溶血性贫血，临床症状差异大，人们着重关注与研究珠蛋白生成障碍性贫血临床异质性的相关因素，如顺式作用因子、DNA甲基化、组蛋白乙酰化、微RNA等。β-珠蛋白生成障碍性贫血患者表型严重程度主要由β-珠蛋白的基因型决定，但一些基因修饰因子(如α-珠蛋白和KLF1基因)在表型调节中也发挥作用。珠蛋白生成障碍性贫血常通过频繁的红细胞输血来治疗，引起铁过载，铁催化活性氧类生成，而过量活性氧类有毒，对心脏、肝脏和内分泌系统等重要器官造成损害，破坏红细胞细胞膜，使红细胞运输氧的能力下降，导致mtDNA结构受损，线粒体功能障碍[43]。

3.3mtDNA基因突变与红细胞和血红蛋白的相关性 线粒体可产生能量，并生成细胞内活性氧类，过量生成的细胞内活性氧类和氧化还原体系失衡均会导致机体氧化损伤，红细胞形态发生改变，膜蛋白构象变化，蛋白交联，脂质过氧化，释放血红蛋白，从而导致红细胞溶血。mtDNA结构破坏和功能紊乱也会导致红细胞发育异常或巨幼细胞性贫血，细胞中氧化损伤开始积累[44-45]。游离球蛋白链和不稳定血浆铁生成的细胞内活性氧类是珠蛋白生成障碍性贫血患者红细胞中活性氧类的主要来源。活性氧类的氧化损伤被认为是细胞损伤、组织损伤和珠蛋白生成障碍性贫血患者血液高凝的主要原因之一[46]。在红细胞中，氧化损伤可将磷脂磷脂酰丝氨酸隔离到细胞膜内层单细胞，削弱转位酶的活性。红细胞表面暴露的磷脂磷脂酰丝氨酸可作为脾脏巨噬细胞捕获和破坏成熟红细胞的信号，从而导致贫血[47]。mtDNA突变的增加可延迟线粒体清除，增加游离铁、红细胞脂质氧化和膜修饰等延缓红细胞的成熟，并在脾脏加速破坏，缩短红细胞的寿命。造血祖细胞对mtDNA突变具有特殊的敏感性，可见mtDNA突变的增加可能是贫血的基础[47]。活性氧类水平升高也会导致细胞毒性和器官功能受损，如心脏、肝脏和大脑。无细胞血红蛋白是血管内溶血的显著标志，最终被氧化为高铁血红蛋白。实验研究表明，高铁血红蛋白可对血小板产生氧化应激，而非血红蛋白，并通过活性氧类介导的线粒体凋亡通路触发血小板死亡[48]。铁过载对珠蛋白生成障碍性贫血的发病起重要作用。在铁过载条件下，多余的铁参与非转铁铁循环，催化芬顿反应生成羟自由基，导致氧化应激。自由基直接导致DNA和其他生物分子(如脂质和蛋白质)发生氧化反应。脂质过氧化副产物可与DNA直接反应形成DNA内收物，影响珠蛋白的表达[49]。

3.4mtDNA基因突变与珠蛋白生成障碍性贫血发生发展的关系 遗传性线粒体疾病由mtDNA或编码线粒体蛋白的核DNA基因缺陷引起，可影响氧化磷酸化复合物、mtDNA翻译和维护、线粒体组装蛋白和线粒体膜组成的亚基[50]。对35例β-珠蛋白生成障碍性贫血患者进行mtDNA的D-loop多态性检测研究发现，与504例正常对照组比较，mtDNA的D-loop核苷酸多态性16069C>T、16189T>C、16319G>A、16519T>C的差异有统计学意义[51]。α-珠蛋白生成障碍性贫血患者线粒体D-loop的序列也呈现出相似的遗传多样性[52]。有研究报道了β-珠蛋白生成障碍性贫血患者线粒体膜通透性的改变，mtDNA受损，还发现不同药物干预下，β-珠蛋白生成障碍性贫血患者线粒体功能障碍的情况[53]。有研究表明，β0-珠蛋白生成障碍性贫血/血红蛋白E病患者与正常对照组的有核红细胞线粒体荧光染色存在显著差异，其线粒体数量在第10天出现显著增多，球蛋白链合成障碍，线粒体损伤与无效红细胞生成同时发生，表明未配对球蛋白链的沉积可能直接影响线粒体的完整性[54]。因此，mtDNA的基因多态性可使珠蛋白生成障碍性贫血基因型与表型之间的相关性复杂化。

4 小 结

mtDNA突变在珠蛋白生成障碍性贫血发病机制中发挥重要作用。目前，国内外对线粒体基因突变与珠蛋白生成障碍性贫血发病机制间的相关性研究较少，且机制尚不完全清楚。深入探究珠蛋白生成障碍性贫血mtDNA突变的相关生物学信息，寻找生物标志物，将为珠蛋白生成障碍性贫血的研究提供新的理论和实验基础，为珠蛋白生成障碍性贫血的治疗提供新的靶点，为临床上防治珠蛋白生成障碍性贫血提供新途径，综合服务于优生优育，并可结合我国丰富的中药材资源，积极寻找新的药物靶位点。