沙棘叶和果实中总黄酮提纯工艺研究进展

周 欣,卫培峰,王丽平,罗文佳,高 峰,欧 莉

(陕西中医药大学,陕西 咸阳712046)

沙棘(Hippop Hae rhamnoides L.)是一种胡颓子科落叶性灌木,主要生长于我国的华北、西南、西北等地区,属药食两用植物。1977年,我国卫生部首次将沙棘正式列入《中国药典》。目前,市面上已经出现了一些对人体健康有益的沙棘产品。经过学者多年的研究,发现沙棘果实具有止咳化痰、健胃消食、活血散瘀之功效；沙棘叶具有增强毛细血管功能及止血、抗凝的作用,并有解痉、抗白癜风、抗肿瘤、麻醉、解热和利胆的作用。沙棘含有包括维生素类、油和脂肪酸类、黄酮类化合物、帖类和甾体类化合物和少量的糖类,多种蛋白质氨基酸以及铁、锌、钾、钠、钙、镁、铜、锰等11种微量元素,营养价值较高[1]。现已证实了黄酮类化合物是沙棘的主要化学成分,其主要包括槲皮素、异鼠李素、杨梅黄素、山奈酚、柚皮素、表儿茶素、白花飞燕草素、3-O-β-D-葡萄糖-(6-O-对羟基反式香豆酰基)山奈素苷、熊果酸等[2]。与此同时有研究发现,沙棘黄酮具有抗氧化、抗心肌缺血、改善心肌细胞功能、改善心肌肥大、抗血栓形成、降血糖、抗过敏、抗癌等药理作用[3]。关于沙棘黄酮的提取方法也有多种,主要有溶剂提取法、索氏提取法、微波提取法、普通超声提取法、循环超声提取法、微波超声双辅助提取法；纯化方法有膜过滤法、大孔吸附树脂法、聚酰胺洗脱法等。本研究主要对沙棘叶和果实中黄酮类化合物的提取纯化工艺进行综述,为今后学者的研究提供理论依据。

1 沙棘叶、果实中黄酮类的提取工艺

1.1 溶剂提取法

溶剂提取法是根据有效成分的溶解度,选择适当的溶剂,将其从药材组织内提取出来的一种提取方法。王元等[4]分别用60%、70%、80%、90%的乙醇溶液、水、无水甲醇、丙酮等,于80

℃回流提取2次来计算提取率,通过比较提取率以及毒性大小,发现无水乙醇是比较合适的提取溶剂,但是无水乙醇成本高,沙棘叶价格低廉,综合考虑,用水作溶剂提取比较经济合理,因此,最后选择水为提取溶剂。通过正交试验优选出最佳的提取条件：提取温度为80℃,提取时间为2 h,料液比1∶12提取2次。李柰等[5]采用单因素优化和响应面优化法,用热水碱提取沙棘叶中的黄酮；通过控制单因素(p H值、时间、温度、质量浓度)来确定最佳提取条件,最适合的p H值是10、时间为2 h、温度为70℃、质量浓度33.3 mg/m L；而响应面优化的热水碱提取沙棘叶中黄酮的最佳条件是p H=11.4、温度为75.5℃、质量浓度为28.6 mg/m L,在此条件下黄酮的产率为1.23%。此法成本低,并且操作简单,适合工业化生产。

袁本香等[6]研究了从沙棘果实中提取黄酮的最佳工艺,采用正交试验对提取黄酮的提取时间、提取次数、料液比以及乙醇浓度4种因素进行了优选；最终根据黄酮的产率选择最佳的工艺条件为：提取温度75℃,料液比控制在1∶8,用60%乙醇连续回流提取3次,每次1 h。袁媛等[7]将水解后的黄酮苷作为评价沙棘果中黄酮提取工艺的评价指标,采用高效液相法测定沙棘提取液未水解以及水解样品中槲皮素、山柰酚、异鼠李素3种苷元的峰,以确定实验中所提取黄酮苷类化合物的含量；用单因素以及正交试验结合的方法来筛选出沙棘果实中黄酮苷的最佳提取工艺条件为：70℃下采用60%的乙醇浸提,固液比1∶15,回流提取(0.5 h×3)。

1.2 微波提取法

微波提取法,运用相似相容原理在电磁场的作用下,将固体或半固体中的有机物成分与基体进行有效的分离,具有波动性、高频性、热特性和非热特性四大特点。杨喜花等[8]采用微波技术提取沙棘叶中总黄酮,通过单因素试验和正交试验来考察微波提取条件对提取沙棘叶总黄酮的影响,最终确定在提取时间为10min、微波功率为400W时,用微波技术提取沙棘叶得到的黄酮提取率最佳。乙醇体积分数为75%,料液比1∶25。微波提取方法与超声循环提取法、索氏提取法相比,从省时的角度考虑,在很大程度上缩短了提取时间,并且增加了提取效率。曹叶霞等[9]以水为介质,对沙棘叶进行微波处理以提取黄酮,通过比较三种单因素(微波功率、时间、料液比)对提取的影响,结果发现：料液比对提取率影响最大,其次是微波功率,提取时间影响最小。其提取效果与常规水浸提法相比,微波提取效率大大提高。实验结果最后验证了微波水提取黄酮的最佳工艺为：微波功率360 W,提取时间3 min,沙棘叶粉与水的质量比为1∶30,提取率为1.21%。J FAN等[10]采用微波萃取技术从新鲜沙棘叶中提取黄酮类化合物,通过单因素和正交试验验证了微波提取的最佳条件：50%乙醇溶液,微波功率550W,辐射时间5min、固液比1∶40；索氏提取法的工艺条件：乙醇溶液(体积比)50%,微波功率550 W,辐射时间5min,固液比1∶40；微波提取与索氏提取法相比,具有节省时间、溶剂用量少、产量高的优势。

1.3 索氏提取法

索氏提取法是运用溶剂回流和虹吸原理用索氏提取器从固体物质中萃取化合物的一种方法,这种方法比较简单易行。郑京等[11]运用索氏提取法从沙棘叶中提取黄酮,然而为了避免黄酮在提取时有误差,先用石油醚将油质及色素等杂质先行除掉,再用80%的乙醇来加热提取,在加热的过程中要求注意避光。通过正交试验得出索氏提取沙棘叶总黄酮的最佳提取条件：用80%的乙醇,提取p H=9,最佳提取时间为6 h；而且要注意提取黄酮时要用50%的氢氧化钠来调节p H,这样有利于控制乙醇的浓度。尹建波等[12]通过索氏提取法从沙棘落叶中提取黄酮,并用氯化铝进行含量测定,从黄酮含量来确定最优提取条件：p H=9,乙醇的浓度为75%,黄酮的含量为36.993 7mg/g。

1.4 普通超声提取法

超声波提取是根据物质中有效成分的溶解度、极性、状态,合理利用超声波的振动来进行提取。此提取方法具有提取温度低、提取率高、提取时间短的独特优势,可替代传统剪切工艺方法,从而实现高效、节能、环保式提取。焦翔等[13]以水和乙醇为提取溶剂,采用浸提法和超声波辅助提取法对沙棘叶中黄酮进行了提取。通过对比发现,在浸提法中乙醇提取率明显高于水提取率,并且超声辅助提取优于浸提法。实验结果证明：超声提取1 h相当于浸提24 h,这大大节省了时间与成本。张益娜等[14]通过超声波提取沙棘叶中的黄酮,以此来研究黄酮的抑菌作用,以60%乙醇为提取溶剂,在40℃条件下,超声30 min来提取黄酮。

曹红等[15]采用超声波辅助提取法提取新疆沙棘果中的总黄酮,采用正交试验来确认超声波辅助提取法提取沙棘果实中总黄酮的最佳工艺条件为：超声波功率150 W,超声波频率20k Hz,提取溶剂乙醇的质量分数为60%,料液比为1∶20(g∶m L),温度为60℃,超声时间为40 min,提取2次。此工艺在相同的提取条件下,相比传统的热回流提取工艺,总黄酮得率提高了0.73%。

1.5 超声循环提取法

超声循环提取法是一种采用物料循环、超声场固定分布、物料在超声场中顺序移动的技术,此技术优于普通的超声提取技术。杨喜花等[16]分别用索氏提取法、超声提取法和超声循环提取法三种方法从沙棘叶中提取黄酮,比较了这三种方法对沙棘叶中黄酮的提取率。研究表明：运用超声循环提取技术,用75%的乙醇、超声提取10min得到的沙棘叶中的总黄酮提取率相当于索氏提取法提取6h的提取率,相比于普通超声法有很大的提高。

1.6 其他提取法

匀浆法是指通过在生物组织中加入提取溶剂进行组织匀浆或磨浆,以提取活体组织中有效成分的一种提取方法。赵春建等[17]将新鲜的沙棘果和提取溶剂在匀浆提取装置中混合匀浆,通过机械作用将物料粉碎,使物料粉碎和有效成分提取同时进行,这样的方法更加简单、快速。最终确定了最佳的工艺参数：将含水率为85%的沙棘果,用85%的乙醇,匀浆10 min,控制固液比为1∶5,在此条件下,提取率最高。与传统的回流提取法相比,匀浆法具有省时、省溶剂的优点。

超声微波双辅助法是将超声波和微波提取法的优点相结合的一种新的提取方法。赵芙蓉等[18]采用超声和微波双辅助提取技术对沙棘叶黄酮进行了提取,利用响应面分析法选出最佳的提取工艺参数：在超声条件(超声时间25 min、超声温度为60℃)不变的情况下,乙醇的质量分数为68.1%,固液比1∶17.7 g/m L、微波火力为80%、辐射时间为3.33min,在此条件下沙棘叶黄酮的含量为42.75 mg/g,此法与一些常见的提取方法比较,黄酮的提取率最高。此提取方法成本低廉、设备简单、操作简单。

2 沙棘叶、果实中黄酮的纯化工艺

2.1 大孔吸附树脂法

大孔吸附树脂法是以独特的吸附溶剂为媒介,从中药水煎液中有选择地吸附其中的有效成分,除去无效成分的一种提取精制的新工艺。大孔吸附树脂纯化方法设备简单、操作方便、节省能源、成本低,并且产品纯度高、不吸潮等。因此,该纯化法在中药有效成分的提取分离过程和生产中的应用日益广泛,且这种方法在中药有效成分分离中的应用在近几年取得了良好的效果。王芃等[19]根据黄酮的结构特点,以其疏水和氢键作用的协同效应,合成了一系列带有弱疏水骨架、酰胺功能基的大孔吸附树脂。结果表明：含有最恰当骨架结构和功能基团的EGDMA是比例为15%的E15NC树脂,而且通过实验发现其对沙棘叶黄酮具有最好的吸附选择性。以总黄酮质量分数为11.14%的沙棘叶黄酮粗提物为原料,经“吸附-解吸”一步连续操作,沙棘叶总黄酮的质量分数就可增加到42.17%,回收率可达85.14%。并且大孔吸附树脂纯化操作简单、成本比较低,对环境污染也较小。此法可用于大规模工业化生产,可以节省成本,并带来更好的效益。李淑珍等[20]选用AB-8型大孔树脂进行吸附纯化,用浓度为0.20 mg/m L,p H=6.0沙棘叶黄酮溶液上样,控制流速为2.0 m L/min；选用70%乙醇进行洗脱,用量为4BV,流速为3.0 m L/min。用此方法,10g沙棘叶粉碎物经提取可得8.71 g粗制品,纯化后得1.29g精制品,总黄酮含量为14.89%,比粗制品黄酮含量大大提高。

2.2 聚酰胺洗脱法

聚酰胺洗脱属于氢键吸附,聚酰胺的洗脱强度与化合物的羟基数目有一定的相关性,羟基数目越多,吸附越牢固,越难洗脱。陈彤彤等[21]创建了一种采用聚酰胺分离纯化沙棘黄酮的方法,以沙棘叶经提取、水解、除杂后所得的粗提物为原料,将此粗提物与1～5倍量聚酰胺粉末搅拌混合,上样于20～60倍量层析用聚酰胺组成的层析柱上,先用不少于2倍柱体积(BV)的水洗去极性杂质,再依次用10%～100%梯度浓度的极性有机溶剂分别洗脱杂质和沙棘叶中黄酮,流速为1～3 BV/h,收集洗脱液,回收溶剂并进行浓缩后,得到沙棘黄酮。

2.3 膜过滤法

膜是具有选择性分离功能的材料,利用膜的选择性分离实现料液的不同组分的分离、纯化、浓缩的过程称作膜分离。根据其孔径的大小,可以分为微滤膜、超滤膜、纳滤膜和反渗透膜,用膜进行过滤的装置简单、占地少、投资少、运行成本低,并且分离、浓缩效果比较好。刘玉平等[22]建立了一种运用膜分离技术进行沙棘黄酮纯化的工艺,在用膜分离前,沙棘果实粗粉先用超临界CO2萃取其脂溶性成分,除去油脂成分后再加乙醇回流提取,而沙棘叶粗粉经加水回流提取后,将得到的沙棘黄酮粗提液先用1500～2000 dalton的膜进行过滤,再用200 dalton的膜进行过滤,得到的沙棘黄酮湿粉再进行负压干燥,最终得到沙棘黄酮粉。此方法与传统的过滤方法相比,是一个物理变化的过程,不需要发生相的变化和添加助剂。

3 结语

随着社会发展和环境恶化,以及人们生活节奏的加快,更多的疾病在日益严重地影响着人们的健康,比免疫力低下、肿瘤、心肌缺血、高脂血症等疾病对人类的健康造成了严重威胁。研究发现黄酮类化合物有较高的治疗价值[23],如沙棘黄酮在人外周血单个核细胞中可以刺激产生白细胞介素以及肿瘤坏死因子,对杀死肿瘤细胞有关键作用[24]；然而对于黄酮化合物的提取工艺各有优劣。本研究探讨从沙棘叶和果实中提取黄酮的方法与纯化工艺,通过研究发现,黄酮的有机溶剂提取方法有甲醇提取和乙醇提取,虽然甲醇提取的黄酮得率比乙醇提取高,但是甲醇毒性比较大,因此选用乙醇作为提取溶剂,可降低成本,减少污染；然而有机溶剂的提取率虽然比较高,但是耗时较长。对不同提取工艺进行评估发现：索氏提取法相比于溶剂提取法,提取溶剂少、设备简便、操作简单、耗时短,适用于实验室；微波提取法用时少,提取的产量也较高；超声波提取和超声波循环提取操作简单,用时也比较短,超声10 min相当于索氏提取6 h,提高了效率；另外匀浆法将原料进行匀浆,也缩短了提取的时间,减少了提取溶剂的用量；超声微波双辅助提取法同时融合了超声和微波的优点,是提取效率最高的一种提取方法,此法设备简单,适用于工厂化大规模生产。传统的有机溶剂提取较为耗时、耗料,如果在设备欠缺的情况下,采用匀浆法可以相应提高提取率；而从时间方面考虑,微波提取法以及超声微波双辅助提取法耗时最短,其次是索氏提取、超声波提取和超声波循环提取,耗时也较短。对于沙棘黄酮产率来说,超声微波双辅助提取法是提取产率最好的提取方法,此法可用于规模化生产。

关于沙棘黄酮的纯化工艺研究,也已取得一定进展。大孔吸附树脂法是目前用于黄酮纯化最多的一项纯化方法,此法操作简单、成本低、对环境污染小,为大规模工业化生产带来了更好的效益。不过,关于膜过滤法和聚酰胺洗脱法用于沙棘黄酮的纯化,研究资料比较欠缺,膜过滤法是一种物理变化的过程,对环境的污染较小；聚酰胺洗脱法则是利用氢键吸附作用,其效果取决于羟基的数目。因此,对于沙棘黄酮的提取纯化方法,应该根据现有的条件,选择适当的提纯方法,以达到最好的提纯效果。