非编码RNA与肝纤维化的研究进展

樊政华,张伟辉

(哈尔滨医科大学附属第一医院微创胆道外科，哈尔滨 150001)

肝纤维化是指各种内源性和外源性损伤因子如炎症、细菌、病毒感染、酒精及药物毒性或遗传因素等作用于肝脏细胞导致的肝内结缔组织异常增生、细胞外基质沉积、肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)活化的病理过程，是多种慢性肝病，包括病毒性肝炎、酒精性脂肪肝以及胆汁淤积性肝病向肝硬化转变的必经阶段。HSC的激活在肝纤维化过程中起主导作用[1]。在正常情况下，HSC通常保持静止状态，其增殖活性及合成胶原的能力较低。但在损伤因子的作用下，HSC可激活并转化为肌成纤维样细胞。肌成纤维样细胞可以分泌促成纤维介质，如转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、结缔组织生长因子、金属蛋白酶组织抑制物等，并生成胶原、纤维连接蛋白以及层粘连蛋白等细胞外基质，从而在肝纤维化的发生中发挥关键作用。

非编码RNA(non-coding RNAs，ncRNA)是指基因转录过程中不编码蛋白质的RNA分子,包括微RNA(microRNA,miRNA)、长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)、小核RNA(small nuclearRNA，snRNA)、核仁小分子RNA(small nucleolar RNA,snoRNA)、小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)等。ncRNA与稳定存在、编码蛋白质的信使RNA(messenger RNA,mRNA)不同，ncRNA数目庞大、功能多样，广泛参与转录和转录后调控、染色质修饰、蛋白质功能调控等过程。许多ncRNA参与调控肝纤维化的发展，其在肝纤维化中的作用机制已成为当前研究的热点。现就ncRNA在肝纤维化过程中的作用予以综述。

1 肝纤维化过程中miRNA的作用机制

miRNA是一类长约22个核苷酸的内源性单链非编码RNA分子，其在肝纤维化中通过调控TGF-β/Smads蛋白、Hedgehog(Hh)、Wnt蛋白、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)、核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)、含半胱氨酸的胱天蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase)等信号通路，对HSC的活化、增殖、凋亡、细胞外基质沉积以及上皮-间质转化等多个方面起调节作用[2]。

1.1 miRNA通过TGF-β信号转导途径调控肝纤维化 TGF-β是一组可调节细胞生长分化的多功能蛋白，可激活其下游信号分子Smads蛋白与膜受体结合并进入细胞核内，通过调节靶基因的转录，影响肝纤维化过程。Murakami等[3]的研究表明，miR-199和miR-200家族都与肝纤维化有关，miR-199 a*和miR-200 b可通过其候选靶点TGF-β诱导因子与Smads特异性e3泛素蛋白连接酶2结合，从而影响HSC的增殖、活化以及上皮-间质转化过程，调节肝纤维化的发展。Sun等[4]的研究显示，miR-200a的表达水平在TGF-β1诱导的HSC激活和四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化中降低，而miR-200a的过表达可显著降低TGF-β1诱导的α-平滑肌激动蛋白(α smooth muscle actin，α-SMA)的表达水平，转染miR-200a后可与其下游β-联蛋白和TGF-β2靶向结合，并抑制mRNA和蛋白质的表达，阻碍HSC增殖活化。Ji等[5]研究发现，miR-27a可作用于其下游分子靶点Smad5及TGF-β通路中腺嘌呤核苷三磷酸-柠檬酸合酶的mRNA，促进HSC活化，降低细胞质脂滴，加剧肝纤维化的发展。miR-155在多个水平影响肝纤维化，可通过血小板衍生因子、Smad2/3以及CCAAT增强子结合蛋白β的直接和间接靶点发挥作用[6]。miR-16的表达水平在丙型肝炎病毒感染诱导的肝纤维化组织细胞中上调，并通过靶向肝细胞生长因子和Smad7负向调节肝纤维化的进展[7]。在四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化中，miR-30c和miR-193的表达下调，通过调节锌指蛋白转录因子和TGF-β2参与肝纤维化的发展[8]。miR-17-5p通过抑制Smad7的表达调节TGF-β/Smad信号转导途径，进而影响Ⅰ型胶原和α-SMA的合成，促进HSC的增殖和活化[9]。Zhao等[10]的研究表明，miR-101对TGF-β1诱导的肝细胞上皮-间质转化过程有明显的抑制作用，可通过结合TGF-βⅠ型受体和锌指转录因子9的mRNA，减少TGF-βⅠ型受体、TGF-β1、血小板衍生生长因子、结缔组织生长因子以及纤维化相关的炎症因子如基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-1及Ⅰ型胶原的产生。另外，miR-101还能靶向结合ZEB1(zinc finger E-box binding homeobox 1) mRNA的3′-非翻译区，抑制ZEB1的表达，影响肝纤维化发展。Ogawa等[11]的研究显示，TGF-β可通过Smad3与miR-29基因启动子结合，诱导miR-29下调，而Smad7基因敲除后能增强TGF-β对miR-29的抑制作用。

在肝纤维化中，miR-29b具有抑制TGF-β1的作用，miR-29 b可通过直接与HSC中Ⅰ型胶原蛋白基因3′-非翻译区和特异性蛋白1基因3′-非翻译区结合，共同抑制Ⅰ型胶原的表达，从而激活HSC[12]。miR-30通过抑制TGF-β信号通路靶基因Kruppel样转录因子11促进Smad7的表达，使HSC增殖和迁移的能力减弱，逐渐由激活状态转化为失活状态，由此抑制肝纤维化的发展[13]。Lakner等[14]将活化的HSC中miR-19b的表达水平提高后，TGF-β信号转导途径中TGF-βⅡ型受体和Smad3的表达明显下降，miR-19b可与TGF-βⅡ型受体的3′-非翻译区直接结合，减少Ⅰ型胶原及α1和α2前胶原mRNA的表达，抑制纤维化过程中HSC的激活。He等[15]发现，miR-146a的表达在肝纤维化过程中以剂量依赖性方式下调，在TGF-β1刺激的HSC中，miR-146a可显著降低Smad4蛋白的表达，表明miR-146a可通过靶向Smad4在TGF-β1诱导期间作为新型调节剂调节HSC的活化。Wang等[16]研究了miR-181a/b对HSC T6增殖的影响发现，TGF-β1处理的HSC T6中miR-181a/b(特别是miR-181b)显著上调,miR-181b可通过调节细胞周期调节因子p27促进HSC增殖。Iizuka等[17]研究显示，在肝纤维化大鼠肝组织中miR-214-5p的表达显著上调，其过表达可激活TGF-β信号转导途径，其机制与Twist-1基因表达上调有关。

1.2 miRNA通过Hh信号转导途径调控肝纤维化 Hh信号转导途径由Hh配体SHH、IHH，膜蛋白受体1、膜蛋白受体2、Smoothened(SMO)以及3种锌指转录因子(Gli1、Gli2和Gli3)等组成，在肝纤维化中与HSC的增殖活化密切相关。Yu等[18]研究表明，miR-152参与其靶基因DNA甲基转移酶(DNA-methyltransferase，DNMT)1 mRNA的降解和转录后调控，促进了Hh信号途径的负调节因子膜蛋白受体1启动子的去甲基化，从而抑制肝纤维化中上皮-间质转化过程。Kumar等[19]研究显示,在胆总管结扎术诱导的小鼠肝纤维化中，miR-29b1可通过调控Ⅳ型胶原蛋白、C-myc癌基因、血小板衍生生长因子β、PI3K/Akt等多种促纤维化基因，抑制Hh信号转导途径的活化及肝细胞外基质沉积，影响肝纤维化的发展。大鼠的HSC活化后，miR-200a的表达下调，其可通过调节锌指转录因子Gli2、上皮-间质转化、Wnt/β-联蛋白以及TGF-β等信号转导途径，抑制Hh信号转导，减少相关基因的表达，影响肝纤维化过程[20]。Hyun等[21]的研究发现，在活化的HSC中，miR-378a-3p的表达水平与Hh信号转导途径中锌指转录因子Gli3的表达呈负相关,miR-378a-3p可通过靶向调节Gli3的活性，影响HSC的增殖活化。

1.3 miRNA通过Wnt信号转导途径调控肝纤维化 Wnt是一类分泌型糖蛋白，由HSC以自分泌的方式释放到细胞外，Wnt通过结合HSC膜上的卷曲蛋白/低密度脂蛋白受体相关蛋白调节HSC的活化[22]。Wnt/β-联蛋白信号通路主要由Wnt蛋白、Dishevelled(Dsh或Dvl)蛋白、特异受体卷曲蛋白、糖原合成酶激酶-3β、β-联蛋白及T细胞因子(T cell factor，TCF)/LEF(lymphoid enhancer factor)转录因子家族等构成。miR-146a-5p抑制HSC活化和增殖的机制是负向调控Wnt1和Wnt5a的表达，通过降低α-SMA、Ⅰ型胶原、MMP-2的表达，增加Smad7的表达，抑制肝纤维化的发生[23]。在肝纤维化中miR-145通过抑制靶基因转录因子ZEB2的表达，抑制Wnt/β-联蛋白通路中β-联蛋白及其下游基因细胞周期蛋白D1和C-myc癌基因影响HSC的增殖活化[24]。在激活的HSC中miR-378a-3p的表达下调，其通过抑制靶基因Wnt10a，促进Wnt/β-联蛋白通路中β-联蛋白的磷酸化和糖原合成酶激酶-3的表达，影响肝纤维化的发生[25]。

1.4 miRNA通过PI3K/Akt信号转导途径调控肝纤维化 PI3K/Akt信号转导途径广泛存在于各种细胞,通过调节下游相关蛋白的表达介导细胞的增殖、活化、迁移、存活以及凋亡。人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(phosphates and tensin homologue deleted on chromosome ten gene,PTEN)是PI3K/Akt信号通路的负向调节因子,在肝纤维化中其编码的产物可使肌醇三磷酸去磷酸化为肌醇二磷酸，从而抑制Akt的活化，进而抑制HSC增殖，诱导HSC凋亡[26]。Bian等[27]研究表明，PTEN表达的缺失可因基因突变(如缺失或插入)或表观遗传学改变(包括启动子高度甲基化)所致，采用DNA甲基化抑制剂5-aza-2′-脱氧胞苷可阻断DNA的甲基化，抑制HSC-T6细胞增殖，下调Ⅰ型胶原和α-SMA基因的表达，且DNMT1的上调可导致PTEN基因启动子甲基化，导致PTEN基因表达下调，HSC活性增强。

Garzon等[28]的研究显示，miR-29b不仅可通过直接靶向DNMT3a和DNMT3b而促进DNA低甲基化,还可通过下调DNMT1基因的转激活因子Sp1，间接降低DNMT1的表达，从而促进DNA低甲基化。在肝纤维化过程中，miR-29b在体内和体外的表达均有所下降，其可通过直接作用于靶基因DNMT3b导致PTEN的甲基化状态缺失，由此抑制Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、Ⅲ型胶原及α-SMA的表达，降低HSC的活化[29]。在四氯化碳处理的小鼠中，miR-29b的引入使α-SMA、Ⅰ型胶原以及金属蛋白酶组织抑制物-1的表达明显下调，miR-29b显著降低HSC细胞和纤维化动物模型中PI3K调节亚基1、Akt3和p-Akt3蛋白的表达，导致PI3K/Akt信号通路失活，诱导HSC凋亡[30]。

Wei等[31]的研究表明，miR-21可使PTEN的表达降低，而PTEN的失活会增加p-Akt及α-SMA、Ⅰ型胶原和MMP-2的表达,使HSC转化为肌成纤维细胞、细胞外基质重塑及间质纤维化，从而影响肝纤维化的发生。在肝纤维化过程中，miR-181b可通过调节PTEN参与PTEN/Akt信号通路以激活HSC，也可通过抑制p27蛋白促进HSC的增殖活化[32]。在HSC活化过程中，miR-200b可通过调节靶基因FOG2(friend of GATA 2)促进HSC增殖和迁移，从而增强PI3K/Akt信号通路中Akt的磷酸化，影响肝纤维化的发生[33]。miR-222可作用于丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2A 55 kDa调节亚基Bα mRNA的3′非翻译区，导致丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2A 55 kDa调节亚基Bα表达的降低，从而激活Akt信号转导途径，抑制HSC细胞凋亡[34]。miR-222的表达在胆管闭锁肝纤维化患者的肝脏中显著升高，而miR-222抑制剂可抑制人HSC LX-2细胞的增殖，这间接支持了miR-222参与激活Akt信号转导途径[35]。Li等[36]研究显示，miR-33a的表达与Ⅰ型胶原增殖及α-SMA的表达密切相关，转染miR-33a抑制剂后，其潜在靶点过氧化物酶体增殖物激活受体α mRNA和蛋白的表达显著增加,影响PI3K/Akt信号通路的激活，减少HSC相关细胞外基质的合成,抑制肝纤维化的发生。

1.5 miRNA通过NF-κB信号转导途径调控肝纤维化 NF-κB是一类核蛋白因子,参与免疫反应、炎症反应、细胞增殖以及分化等生物过程。NF-κB家族主要由p50、p52、RelA(P65)、RelB和cRel组成，其形成同源二聚体或异二聚体，其中p50-RelA(又称p50-p65)是NF-κB中含量最多的一种。在静止状态的细胞中，大部分的NF-κB二聚体通过与NF-κB抑制蛋白(inhibitor-κ binding protein，IκB)α、IκBβ、IκBε中的某一个结合，而处于无活性状态，可通过降解IκBs的方式活化NF-κB，IκBs可被IκBs激酶磷酸化，活化的NF-κB转移到细胞核内与DNA结合，并作为转录因子发挥作用。NF-κB是炎症反应的重要介质，可通过激活细胞因子级联反应以及产生其他促炎介质促进HSC激活，促进肝细胞上皮-间质转化,从而导致肝纤维化。一些miRNA可调节NF-κB的表达。

Feng等[37]研究了miR-126在HSC活化过程中的作用,上调miR-126的表达在转录后水平明显抑制了其下游靶点IκBa的表达，导致NF-κB激活，并促进其下游信号因子如TGF-β1、Ⅰ型胶原等的表达；而抑制miR-126后可使IκBa蛋白上调，抑制NF-κB活化，导致肝纤维化的发生。Hyun等[21]发现，在肝纤维化中miR-378a-3p的表达下调，使用SMO基因激活NF-κB后可抑制miR-378a-3p的转录表达，miR-378a-3p的减少则可引起锌指蛋白Gli3和Gli2表达的增加，从而促进Hh信号蛋白的表达，加速肝纤维化的形成。

1.6 miRNA通过胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)信号转导途径调控肝纤维化 ERK包括ERK1和ERK2，是一类丝/苏氨酸蛋白激酶，参与调节各种生物效应如细胞增殖、分化、凋亡。Dai等[38]发现，ERK1信号通路通过促进有丝分裂和纤维化促进HSC活化，并在肝实质上皮细胞的上皮-间质转化过程中加速成纤维细胞的转变；抑制ERK1信号通路可能起到抑制肝纤维化发展的作用。Ye等[39]的研究表明，miR-155可直接与TCF4 mRNA的3′-非翻译区和血管紧张素Ⅱ受体1结合，TCF4是促进上皮-间质转化的转录因子，血管紧张素Ⅱ受体1可增强ERK1信号通路活性，TCF4和血管紧张素Ⅱ受体1可能是miR-155的靶基因，通过调节上皮-间质转化过程和ERK1信号转导途径促进肝纤维化。Zhao等[40]研究显示，在肝硬化患者和大鼠血清和肝组织中miR-21的含量显著升高，miR-21可通过靶向抑制侧支发芽因子同源物2的表达刺激HSC活化，以增强ERK1信号，同时还可通过下调肝细胞核因子4α的表达，触发肝细胞的上皮-间质转化过程，从而促进成纤维细胞的积累，影响肝纤维化进展。

1.7 miRNA通过caspase信号途径调控肝纤维化 caspase是一类富含半胱氨酸的蛋白酶家族，通常在细胞中以无活性的酶原形式存在，其内部特异的天冬氨酸残基部位经裂解加工后可引起酶原激活，并诱导HSC凋亡。Guo等[41]研究显示，在大鼠静止期和活化期HSC中miR-15b和miR-16的表达水平与B细胞淋巴瘤-2基因水平呈负相关，其可能通过靶向B细胞淋巴瘤-2和caspase信号转导途径而对HSC的凋亡起关键作用。

2 在肝纤维化过程中lncRNA的作用机制

lncRNA广泛存在于真核细胞内，是一种由聚合酶Ⅱ转录的长度超过200个核苷酸的非编码RNA，本身并不编码蛋白质，但其在肝脏纤维化过程中发挥着重要作用。研究发现，lncRNA-MALAT1不仅作为内源竞争性RNA通过碱基互补配对与miR-101或PrimiR-101b结合，而且还能促进靶基因Rac1的表达[42]。lncRNA-MALAT1还可与组蛋白去乙酰化酶沉默信息调节因子结合以抑制其降解，从而促进HSC的活化[42]。研究表明，浆细胞瘤变异易位1通过竞争性结合miR-152抑制膜蛋白受体1的表达，从而激活Hh和上皮-间质转化信号通路，从而促进HSC的活化，影响肝纤维化的形成[43]。Zhang等[44]研究发现，lncRNA生长停滞特异性转录本5通过RNA诱导的沉默复合体负向调节miR-21，而miR-21可通过调节PTEN以及Akt通路，上调MMP-2的表达，进而参与肝纤维化。lncRNA 生长停滞特异性转录本5还可竞争性结合miR-222，使其靶基因周期素依赖激酶抑制剂p27的表达上调，从而抑制HSC活化及肝纤维化的发生[45]。

Zhou等[46]研究发现，甲基化CpG结合蛋白2过表达会降低HSC中lncRNA H19的水平，敲除甲基化CpG结合蛋白2可降低其表达。同时，敲除lncRNA H19可增加胰岛素样生长因子1受体蛋白的表达水平，过表达则可减少。因此，lncRNA H19对肝纤维化的发展具有双重调节作用。Bian等[47]研究表明，miR-148b模拟物的转染降低了HOX转录反义RNA的荧光素酶活性，明显抑制了lncRNA HOX转录反义RNA介导的HSC活化。敲除miR-148b后，lncRNA HOX转录反义RNA的表达增加，表明 HOX转录反义RNA和miR-148b是相互作用的靶点，并且双向调控着HSC的活化。lncRNA人母系表达基因3能够激活p53，并且活化的p53转移至线粒体外膜与Bcl-2家族成员相互作用，使细胞色素C的释放增加，激活caspase及p53/caspase-3信号转导途径以诱导HSC失活，从而抑制肝纤维化的发展[48]。有研究发现，被TGF-β活化的lncRNA在肝纤维化患者肝组织和血浆中的表达显著增加，被TGF-β活化的lncRNA可与TGF-β受体Ⅱ、Smad2竞争性结合miR-425-5p以促进胶原形成及HSC活化，从而影响肝纤维化的发生[49]。lncRNA-Alu调控的p21转录调节因子(Alu-mediated p21 transcriptional reyulator,APTR)的表达在活化的HSC和肝硬化患者的血清中明显增加，沉默APTR能够解除HSC内TGF-β1诱导的α-SMA表达的上调；敲除APTR能够抑制体内HSC的激活和胶原的累积，同时其细胞周期和细胞增殖也被抑制，而这种作用可通过沉默p21缓解，说明APTR可通过抑制p21的转录促进HSC的激活和增殖，影响肝纤维化的发生[50]。

3 问题与展望

除miRNA、lncRNA外，其他ncRNA如snRNA、snoRNA、siRNA等也在肝纤维化中发挥着重要作用，但由于数目众多，并且ncRNA可作用于不同的靶基因调节肝纤维化，而相同的靶基因又受到不同ncRNA的影响,其关系错综复杂，目前研究尚处于初期阶段。因此，筛选在肝纤维化过程中发挥重要作用的ncRNA，了解其调控机制，根据基因靶点、环节,研发更为安全、高效、有针对性的药物,将对肝纤维化及肝硬化的预防和治疗产生深远影响，为阐述慢性肝病的病理生理过程提供新思路，也为慢性肝病的治疗提供新方向。