IGFBP-6与类风湿关节炎关系的研究进展

孙 莉,王晓非

(中国医科大学附属盛京医院风湿免疫科,沈阳 110022)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种常见的慢性风湿性疾病，全球患病率约为1%,女性明显多于男性[1]。RA的典型临床表现为多关节肿胀、疼痛，可累及心脏、皮肤、肺脏、胃、肾脏等多个器官[2]。RA的发病机制复杂，免疫细胞自外周血迁移至关节局部是滑膜炎发生的关键。滑膜增生、血管翳形成以及免疫细胞过度迁移、凋亡减少等共同作用导致关节局部炎症长期持续存在，引起关节破坏，影响患者的工作和生活。RA目前尚无根治方法，临床治疗主要是缓解病情。随着分子生物学技术的不断发展，RA的发病机制在基因、蛋白以及细胞水平逐渐完善，治疗手段也更加丰富多样，但仍有部分患者经过充分的药物治疗仍不能达到临床缓解[3]，提示有不明因素参与RA的发病过程。胰岛素样生长因子结合蛋白-6(insulin-like growth factor binding protein-6,IGFBP-6)是胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor,IGF)活性的调节因子，IGF与RA的关系已得到证实[4]。研究发现，IGFBP-6也可通过IGF非依赖途径诱导胶质瘤、结肠癌等肿瘤细胞迁移[5-6]。该功能的发现使IGFBP-6与RA的关系备受关注。现对IGFBP-6的生理功能及其在RA发病机制中的作用进行综述。

1 IGF家族概况

IGF家族主要由2种IGF、3种IGF受体、6种IGFBPs、IGFBP相关蛋白以及IGFBPs蛋白酶组成。IGF包括IGF-1和IGF-2，其是细胞增殖发育必需的调控因子。IGF之所以被命名为“胰岛素样”是因为其在结构上与胰岛素前体有50%的同源性，且能调节糖代谢。IGF-1在抗凋亡、调节生长发育方面起重要作用[7]。IGF-1是生长激素调节合成代谢的主要介质。IGF-2，又称为生长调节素A，具有复杂的生理功能，是已知最复杂的生长调控因子[8]。IGF-2能够促进细胞的有丝分裂，其与IGF-1受体结合后激活酪氨酸激酶，进而激活胰岛素受体底物1，引发序列反应[9]。IGF-2是多种肿瘤的自分泌生长因子，与肿瘤预后相关[8]。

IGF-受体是细胞表面的跨膜糖蛋白，包括IGF-1受体、IGF-2受体以及胰岛素受体。IGF-1受体、IGF-2受体具有不同的结构与功能。IGF-1受体是四聚体，由2个相同的α亚基和2个相同的β亚基构成，IGF-1和IGF-2主要与IGF-1受体结合发挥生理作用[10]。IGF-2受体为单体，与IGF-2结合促进IGF-2水解[11]。

IGF的生理活性主要由IGFBPs调节。IGFBPs在结构上具有高度同源性，但功能及作用机制各不相同[12]。IGFBPs作为IGF的载体，血清中约98%的IGF与IGFBP结合形成二聚体或三聚体以保护IGF免受降解，并被运送到特定组织发挥作用。处于游离状态的IGF才能发挥生理作用。IGFBPs通过竞争性抑制IGF与IGF-受体的结合，调节IGF的活性[10]。IGFBPs均能抑制IGF的活性，但在某些特定环境可增强IGF的活性[13]。IGFBPs亦能阻止IGFs与胰岛素受体的结合，从而避免严重低血糖。

1.1 IGFBP-6的结构及表达 IGFBP-6是IGFBPs的一员，在结构和功能上与其他IGFBPs具有共性，但同时也具有特性。IGFBP-6属于分泌型糖蛋白，主要由肝脏星形胶质细胞合成与分泌，广泛存在于人体组织的细胞和体液中,在肺、肝、肠以及中枢神经系统均有表达[13]。IGFBPs有3个共同的结构域：N端、C端以及中间区。N端和C端在结构上高度保守，而中间区结构易变。C端和N端在二硫键的作用下形成稳定的球形结构，共同组成IGF的结合位点。IGFBP1-5的N端有4个保守的二硫键，而IGFBP-6仅有3个，且三维结构与前者不同。IGFBP-6的C端还含有与IGFBP-3和IGFBP-5相似的肝素结合序列。IGFBP-6存在多种转录后修饰，包括糖基化、硫化、磷酸化，糖基化可能与IGFBP-6对IGF-2有相对较高的亲和力有关[13]。IGFs、转化生长因子(transforming growth factor,TGF)-L、糖皮质激素、雌二醇、视黄酸、维生素D、p53等均能以细胞特异性方式调节IGFBP-6的表达和分泌，其中视黄酸是调节IGFBP-6表达最强的刺激因子[14]。

1.2 IGFBP-6的生理功能 IGFBP-6通过IGF依赖和IGF非依赖两种途径发挥功能。IGFBP-6与IGF-2结合的亲和力是IGF-1的70～100倍，对IGF-1几乎无影响[10]。IGFBP-6的经典作用途径即IGF依赖途径，其是通过与细胞表面受体竞争性结合IGF-2，从而抑制IGF-2介导的促细胞增殖、分化以及生长作用[15]。近年来研究较多的是IGFBP-6独立于IGF-2的作用,其是指IGFBP-6既不与IGF-受体结合，也不调节IGF-受体，而是独立产生作用，包括抑制血管新生、促进细胞迁移[16]。Aboalola和Han[17]研究发现，IGFBP-6可通过IGF非依赖途径促进肌肉分化。IGFBP-6通过IGF非依赖途径发挥作用的机制尚不完全明确，结合细胞表面及胞质内的非IGF配体、激活细胞内的信号通路、调节胞质-胞核的移位以及核内作用等可能是其作用机制[13]。IGFBP-6含有一个核定位序列，位于C端，与输入蛋白-α结合介导IGFBP-6进入细胞核内,通过调控基因转录，调节细胞的分化与生长，该过程不受IGF-2的影响[13]。Ku80是修复和稳定DNA的蛋白质，IGFBP-6可通过与Ku80结合后扰乱DNA修复过程而抑制细胞生长[18]。IGFBP-6的IGF依赖与IGF非依赖途径并非完全独立，IGFBP-6可同时通过IGF依赖性和非依赖性途径抑制成纤维细胞增殖。同样，在不同细胞系中IGFBP-6可通过不同途径诱导细胞凋亡[15]。

2 RA的发病机制

RA是一种常见的慢性炎症性弥漫性结缔组织病，病因复杂，遗传和环境因素协同作用导致疾病的发生，其病理改变是多种免疫细胞与炎症因子共同作用的结果。RA的三大主要特征是持续性滑膜炎、全身性炎症以及自身抗体的产生。经过多年研究已经发现了与RA发生、发展相关的信号通路，但具体发病机制及关节作为主要受累部位的原因仍不十分明确。RA的治疗药物主要包括抗风湿药、激素以及生物制剂。目前针对发病机制已经开发出多种生物制剂，如肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α抑制剂、白细胞介素(interleukin,IL)-6抑制剂、IL-1受体拮抗剂、B细胞清除剂、T细胞抑制剂等，并已应用于临床，大部分患者取得了良好的治疗效果，但依然有部分顽固性RA患者不能获得临床缓解，提示仍有未阻断的信号通路，RA的发病机制仍需深入探索。

RA受累关节的病理改变过程复杂。首先是关节内滑膜细胞过度增殖，凋亡减少，增殖与凋亡比例失衡，大量增生的滑膜细胞诱导低氧环境，血管代偿性新生，并产生大量趋化因子，炎症细胞包括淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞等在趋化因子的作用下自外周血迁移至受累关节，引起关节炎症[16]。新生血管携带氧气、葡萄糖等养料，为炎症细胞提供良好的生存环境，进而形成恶性循环。血管翳主要由异常增生的滑膜细胞、新生血管以及炎症细胞组成，具有“类肿瘤样”性质，能够侵袭软骨及软骨下骨组织，导致关节不可逆性破坏、畸形以及功能丧失。滑膜增生是滑膜炎形成的始动事件，而外周血炎症细胞迁移至受累关节是滑膜炎形成的关键事件。滑膜细胞过度增殖、代偿性血管新生、炎症细胞迁移等过程均由多种炎症细胞因子及趋化因子等通过错综复杂的信号通路综合调控。

3 IGFBP-6与RA的关系

IGFBP-6是IGF活性的调节因子。IGF-1具有促进骨和软骨组织生长和分化，促进软骨基质合成，维持软骨自我更新以及抗炎作用，可通过抑制血管氧化应激、细胞凋亡以及炎症反应调节免疫和炎症过程[19]。段京明等[4]研究表明，IGF-1的水平与RA疼痛及肿胀关节数呈负相关，提示IGF-1与RA的病情活动度相关；RA伴骨质疏松者IGF-1的水平显著低于不伴有骨质疏松者，提示IGF-1参与RA的骨破坏过程。以上研究均说明IGFBP-6可能与RA相关。IGFBP-6对肿瘤有双重影响：一方面，IGFBP-6通过抑制IGF-2的活性及IGF非依赖途径抑制血管新生，发挥抑癌作用；另一方面，IGFBP-6也促进肿瘤细胞迁移，显示了致癌作用。

3.1 IGFBP-6与炎症细胞活化 中性粒细胞胞外网状陷阱(neutrophil extracellular traps,NETs)是近年来发现的一种新的中性粒细胞杀菌机制，RA关节滑膜液内的中性粒细胞激活后产生大量的NETs，同时中性粒细胞活化过程中大量组氨酸瓜氨酸化，而瓜氨酸化的蛋白是刺激RA产生抗瓜氨酸蛋白抗体的重要抗原[20]，抗瓜氨酸蛋白抗体特异性结合破骨细胞和破骨细胞前体，促进破骨细胞分化，刺激破骨细胞释放IL-8，进而引起骨侵蚀和疼痛[21]。RA患者外周血和滑膜液中NETs的生成过程增强，并与抗瓜氨酸蛋白抗体水平及关节炎症具有相关性[22]。NETs亦可诱导滑膜成纤维细胞表达大量促炎细胞因子。以上均说明中性粒细胞在RA发病机制有重要作用。

Conese等[23]研究发现，IGFBP-6影响炎症状态下中性粒细胞的功能，包括活性氧类的产生、颗粒释放以及趋化效应。IGFBP-6是中性粒细胞活性的激动剂，与空白对照组相比，应用IGFBP-6处理后，中性粒细胞活性氧类的生成明显增加[23]。应用N-甲酰基-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine,fMLP)或佛波醇酯孵育并经IGFBP-6预处理的中性粒细胞，与仅用fMLP或佛波醇酯处理的中性粒细胞相比，中性粒细胞活性氧类的产生无差异；对于脱颗粒，fMLP可明显促进中性粒细胞释放髓过氧化物酶和基质金属蛋白酶-9，IGFBP-6虽然明显提高了髓过氧化物酶的水平，但并不影响fMLP对中性粒细胞的刺激效应，提示IGFBP-6可能通过fMLP和佛波醇酯的信号转导通路(包括由磷脂酶C、磷脂酰肌醇-3-激酶以及Src家族激酶构成的fMLP通路和蛋白激酶C构成的佛波醇酯通路)发挥效应的[23]。综上，IGFBP-6虽不能引发中性粒细胞的炎性效应，但可能在炎症反应后期起到放大炎症的作用。

3.2 IGFBP-6与血管翳形成 缺氧是血管生成的主要调节因素。缺氧诱导因子1α和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是已知的促进血管新生的重要细胞因子[24]。缺氧诱导因子1α的激活与缺氧诱导的IGFBP-6基因的表达相关，在内皮细胞中，缺氧诱导因子1α诱导的缺氧环境上调了IGFBP-6的表达[25]。但对横纹肌肉瘤和斑马鱼胚胎的研究发现，IGFBP-6的过表达抑制了血管生成，且此作用独立于IGF-2,提示IGFBP-6可能参与缺氧诱导的血管生成的负反馈调节[25]。血管新生是RA关节炎症早期的关键事件，是促进炎症细胞浸润、维持血管翳以及导致慢性炎症持续存在的重要因素，并贯穿关节炎病理过程的始终[26]。在滑膜血管新生过程中VEGF具有关键作用[27]。作为促血管形成的最重要的细胞因子，RA关节中过表达VEGF可直接促进血管内皮细胞增殖，与RA血管翳的形成直接相关，也是RA直接的促炎因子，其可上调基质金属蛋白酶的水平，引起一系列炎症反应[27]。Zhang等[25]的研究表明，在体外培养的血管内皮细胞的培养基中单独加入IGFBP-6后抑制了血管生成，而单独加入VEGF时则明显促进血管形成，IGFBP-6与VEGF共同作用抑制VEGF刺激血管生成的作用。据此推测，IGFBP-6可能通过抑制VEGF的功能参与调节RA血管翳形成，但IGFBP-6与RA血管翳生成的关系尚未得到直接证实。

3.3 IGFBP-6与骨代谢 RA的骨破坏在疾病早期即可出现，软骨及骨的破坏是关节内骨质分解代谢超过合成代谢的结果。骨形成和骨丢失平衡的维持主要取决于成骨细胞的功能状态。破骨细胞的主要作用是骨吸收，是RA骨破坏的关键细胞成分[28]。IGF作为生长因子，同样能调节软骨及骨组织代谢。IGF-1能促进骨和软骨组织的生长和分化，IGF-2对骨骼生长也有一定的作用，而IGFBP-6可通过减少骨微环境中IGF-2的生物利用度调节成骨细胞的生长[29]。碱性磷酸酶是骨分化的标志物。研究发现，IGFBP-6水平的升高显著降低了人成骨细胞和成骨细胞样骨肉瘤细胞碱性磷酸酶的活性，并通过细胞内机制抑制成骨细胞分化[30]。维生素D受体(vitamin D receptor,VDR)属于配体依赖的转录因子核受体超家族，通过与1,25-二羟维生素D3结合而识别靶基因，调节碱性磷酸酶、生长激素等的表达，参与调节细胞的生长发育、免疫反应、物质代谢等功能[31]。维持骨稳态是VDR的经典功能，其通过促进肠道吸收食物中的钙而维持体内正常的钙磷平衡并间接调节骨矿化。IGFBP-6可内化并进入细胞核与VDR结合。与仅转染VDR的细胞相比，IGFBP-6和VDR共转染时，1,25-二羟维生素D3与VDR结合介导的骨钙素和生长激素启动子的转录和表达活性均明显下降；在1,25-二羟维生素D3存在的前提下，将表达IGFBP-6的质粒瞬时转染到MG-63和U2-OS细胞中，碱性磷酸酶活性显著降低；而敲除内源性VDR时，转染后碱性磷酸酶活性无明显变化，提示IGFBP-6能够抑制VDR的转录激活活性和细胞对1,25-二羟维生素D3的应答反应，IGFBP-6抑制骨代谢依赖于VDR[32]。

3.4 IGFBP-6与炎症细胞迁移 受累关节组织内炎症细胞增多是RA的一个重要特征，是关节炎症和破坏的关键，主要包括B淋巴细胞、T淋巴细胞、RA-成纤维样滑膜细胞、单核细胞。核因子κB受体激活蛋白配体(receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)对破骨细胞的活化起关键作用，在外周血的B淋巴细胞中未发现RANKL，滑液和滑膜组织中的B淋巴细胞是RANKL的唯一载体[33]。RA-成纤维样滑膜细胞被炎症因子活化后具有“类肿瘤样”性质，在多种趋化因子的作用下迁移至软骨表面并侵袭关节面，其是关节破坏的重要环节。目前认为，炎症细胞增多主要是炎症细胞募集至受累关节所致，而非局部白细胞增殖[34]。现已明确IGFBP-6能促进胶质瘤、结肠癌等多种肿瘤细胞迁移，并与除肿瘤细胞之外的多种炎症细胞的迁移有关，提示IGFBP-6可能与RA中细胞迁移机制相关[5-6]。Liso等[35]发现，单核细胞转化的树突样细胞接受高热(39 ℃)刺激后，IGFBP-6的表达明显上调。与基质细胞衍生因子-1 (对单核细胞、T细胞以及B细胞均具有趋化作用)阳性对照组相比，IGFBP-6以剂量依赖模式趋化单核细胞，对T细胞亦有趋化作用，且与基质细胞衍生因子-1的作用模式类似，但未发现对B细胞有明显的趋化作用。近年来研究发现，RA患者的血液中含有IGFBP-6抗体，提示RA体内可能存在IGFBP-6的异常表达[36]。Alunno等[37]的实验首次直接证实了IGFBP-6与RA的关系,研究发现，规律治疗大于6个月的RA患者，血清IGFBP-6的水平较健康对照组明显升高；虽然在RA滑膜液中也能检测到IGFBP-6，但水平明显低于骨关节炎患者，而RA患者滑膜组织中IGFBP-6的水平明显高于骨关节炎患者。进一步分析发现，滑膜液中IGFBP-6的水平与白细胞计数及血小板计数呈负相关，可能是因为IGFBP-6被白细胞内化及血小板产生的基质金属蛋白酶-2降解[37]。RA外周血中表达IGFBP-6的T细胞明显低于健康对照组，而滑膜组织中表达IGFBP-6的T细胞明显增多[37]。体外实验发现，迁移至关节滑膜的T细胞大多表达IGFBP-6，提示表达IGFBP-6的T细胞自外周血迁移至关节滑膜[37]。同时，IGFBP-6可作为趋化因子，诱导RA患者的免疫细胞迁移至滑膜，该趋化作用主要作用于CD3+T细胞，并且该趋化作用可被激素部分抑制。体外模拟实验发现，IGFBP-6诱导中性粒细胞迁移[23]。

4 结 语

RA是临床上至今无法治愈的疾病，发生、发展过程复杂，涉及细胞的生长、增殖、迁移等各个过程，攻克这一疾病的首要任务是明确发病机制及发病过程中关键的调控因子。IGFBP-6可调节细胞的生长、分化、增殖、迁移等过程，目前的研究已经明确IGFBP-6与多种疾病相关，在肿瘤性疾病中受到广泛关注，可能为抗肿瘤治疗提供新的靶点。在RA中IGFBP-6可促进免疫细胞迁移至关节，导致软骨及骨的破坏，且IGFBP-6可通过抑制VDR的功能抑制骨代谢，可能为RA的研究及治疗提供新视角。但IGFBP-6生理功能复杂多样，可促进细胞迁移参与RA的发病过程，但也能抑制血管新生和成纤维细胞增殖，可能是RA的保护因素，两者的主导地位决定了IGFBP-6在RA中的最终生物效应，理解两者的平衡关系至关重要。目前已经发现IGFBP-6相关的细胞表面受体及信号通路，但某些结论尚存在分歧，具体的分子机制仍待进一步探索，以便应用于临床诊断及治疗。