Rab6蛋白的结构和功能

王 芳，杨俊俊，徐兴祥

(江苏省苏北人民医院呼吸内科 扬州大学临床医学院, 江苏 扬州 225001)

Rab蛋白是一类小分子鸟苷三磷酸(guanosine triphosphate,GTP)结合蛋白，由200个左右的氨基酸组成，相对分子量为20 000～30 000。Rab蛋白具有一些共同的结构特征，即由保守的G结构域和高度可变的N端和C端组成。G结构域有5个α螺旋(A1～A5)、6个β片层(B1～B6)和5个多肽环(G1～G5)，5个多肽环具有高度保守的氨基酸序列，能连接α螺旋和β片层[1-2]。目前为止,在人类中已发现70多种Rab蛋白，酵母中发现约11种。Rab蛋白普遍存在于所有真核生物中，作为各细胞器之间囊泡运输的分子开关，在真核细胞中Rab蛋白参与几乎所有的细胞膜运输过程，并且通过与各种效应器的结合，进一步影响细胞的增殖、分化、凋亡，进而决定细胞的生命进程[3-4]。Rab家族成员之间的氨基酸序列有75%～95%的相似性，其中包括Rab6。Rab6是一个与高尔基体相关联的GTP酶，是Rab成员之一，具有Rab中最低的GTP酶活性，其水解活性为5×10-6/s[5-6]。Rab6能通过与各种效应因子相互作用，对细胞内物质转运不仅起调控作用，而且也发现与病原体吞噬、神经元的功能、有丝分裂等有关[7-9]。此外也发现Rab6与多种疾病的发生发展关系密切[10-11]。现从Rab6的结构、效应因子以及在不同疾病中的发挥的功能方面，阐述Rab6蛋白。

1 Rab6的亚型

Rab6与Ras、Rho和Ran亚家族属于Ras超家族,是Ras超家族的一个分支，与Ras保持 30%～60%的同源性[5]。蛋白质组学分析显示，Rab6含有丰富的与高尔基体相关联的Rab蛋白，主要定位于反式高尔基体腔和管网状结构的膜上[12-14]。目前Rab6蛋白在高尔基体膜上定位的具体机制尚不十分明确。现有研究表明，Rab6的定位主要取决于N端的71种氨基酸，而C端的多态性也可能有一定作用[15]。目前在人类中已发现4种Rab6的亚型：Rab6A、Rab6A′、Rab6B和Rab6C(也称为WTH3)，而大多数生物体，如果蝇，仅有1种Rab蛋白[3]。

Rab6A和Rab6A′是最早发现的Rab6异构体亚型，由同一基因选择性剪切而来。有研究发现Rab6A′和Rab6A的差异仅存在于PM3保守结构域(GTP-结合结构域)两侧的3个氨基酸之间，即Val62→lle和Thr87/Val88→Ala/Ala。Rab6A′和Rab6A定位于第11号染色体。经逆转录-聚合酶链反应技术检测发现，Rab6A′和Rab6A在组织中广泛表达，并且无明显表达差异，但在膜的转运过程中行使功能不同，具体功能尚不明确[16-17]。Rab6B亚型是一个由Rab6A′和Rab6A非剪接的复制基因，氨基酸序列与Rab6A′和Rab6A有91%的相似，只在C端存在差异。Rab6B定位于第3号染色体，在高尔基体上大量表达。有研究表明，Rab6B在神经系统中特异性表达，但其余的Rab6亚型在神经元中也有表达[10-19]。Rab6C作为Rab6的新亚型被发现，拥有单一的外显子结构，是一种灵长类动物特定的逆基因。因Rab6C由RAB6A′mRNA反转录而来，曾被命名为RAB6A′[20]。Rab6C定位在第2号染色体上，在哺乳动物多种组织中均有表达，现已在乳腺、大脑、睾丸、前列腺组织中发现，但由于其转录数量有限，所以内源性Rab6C含量较低，呈现低表达。并且研究发现，过表达的Rab6C会使细胞在有丝分裂第一间隙期即G1期发生停滞[21]。

2 Rab6蛋白的效应因子

与其他GTP酶一样，Rab6蛋白具有两种形式，鸟苷二磷酸(guanosine diphosphate，GDP)为失活形式，GTP为活性形式，在发挥功能时不断进行GTP/GDP循环。当Rab6蛋白结构域上的GDP被GTP替代时，Rab6蛋白激活，活化后的Rab6-GTP通过激活和招募细胞内Rab6的多种效应因子，对早期内涵体的再循环、胞吞和早期内涵体融合等起调节作用[18]。目前多种Rab6蛋白效应因子经酵母双杂交和免疫共沉淀等方法发现，例如Rab驱动蛋白-6(Rabkinesin-6)、肌凝蛋白Ⅱ、动力蛋白-动力蛋白激活蛋白(dynein-dynactin)复合体、GTP酶激活蛋白、Rab6相互作用蛋白1(Rab6-interacting protein 1,Rab6IP1)、Rab6相互作用蛋白2(Rab6-interacting protein 2,Rab6IP2)、β淀粉样前体蛋白结合蛋白3等[22]。

Rabkinesin-6定位在高尔基体上，与Rab6A相互作用，能够参与高尔基体沿微管到内质网的反向运输。虽然Rabkinesin-6不能与Rab6A′相互作用，但沉默Rab6A′或Rab6A后，高尔基体形态会发生改变，从而影响高尔基体-内质网循环[18]。一种特殊的肌凝蛋白Ⅱ，作为Rab6效应蛋白，能参与囊泡在高尔基体管网状结构上的转运[23]。Miserey-Lenkei等[24]发现Rab6A′/A在活性状态下能直接将肌凝蛋白Ⅱ招募到高尔基体上，在肌动蛋白(actin)的协助下完成囊泡的分裂。

Bicaudal-D(BICD)和dynein-dynactin复合体同作为Rab6的效应蛋白，当BICD被位于高尔基体上的Rab6识别后，通过与pl50Glued互相作用，招募dynein-dynactin复合体到高尔基体上，从而介导高尔基体和内质网之间的运输。pl50Glued作为dynactin复合体的一个亚基，与Rab6A′/A作用后和微管相连，使囊泡能够在微管上移动，最后通过效应蛋白Rab6IP2协助囊泡与细胞膜锚定融合。虽然Rab6A′/A参与到高尔基体-内质网之间的运输，但Rab6A并不是必需的[18]。

3 Rab6蛋白的功能

3.1Rab6调控细胞吞噬 细胞吞噬是生物体最基本的防卫机制之一，是宿主消化病原的直接途径。细胞吞噬是单细胞动物摄取营养物质的主要途径，但是在多细胞动物中，部分细胞特化为吞噬细胞，能利用吞噬作用来杀死和消除病原体以及损伤组织，来保持自身的稳定和对外防御[25]。吞噬是一个动态的过程，主要由于actin的聚集导致细胞膜结构的改变引起。而actin的聚集是由于小G蛋白的磷酸化传导信号介导的[26]。由此可以看出，小G蛋白家族在细胞吞噬中起到了重要的作用。在对虾抗病毒免疫研究中发现，当Rab6蛋白优先与对虾白斑综合征病毒的膜蛋白VP466(对虾白斑综合征病毒的膜蛋白)结合时，导致actin聚集，进而增强细胞吞噬活性，抑制病毒感染；但是当原肌球蛋白优先和VP66蛋白结合时，actin构象朝利于病毒感染的方向变化，进而促进病毒感染[27-29]。进一步研究发现，在对虾血淋巴细胞和果蝇S2细胞中发现，Rab6通过与actin相互作用影响actin骨架的构象来调控吞噬[28]。由此推测Rab6蛋白在无脊椎动物吞噬过程中起作用。为探究Rab6蛋白是否在哺乳动物吞噬过程中起作用，Chen等[9]用小鼠巨噬细胞株RAW264.7为实验对象，利用小干扰RNA沉默基因，发现当Rab6被敲低时，巨噬细胞对金黄色葡萄球菌消化率下降，而Rab6过表达时使消化率提高20%。由此说明Rab6调控巨噬细胞`杀死和消化金黄色葡萄球菌过程中起积极作用。此研究还证实，BICD1在作为BICD的同源异构体的同时，也作为Rab6的效应蛋白，与Rab6行使相同的功能，参与物质在细胞膜之间的转运，且在吞噬小体的成熟过程中起作用。

3.2Rab6与神经元功能 神经元是神经系统的结构和功能单位，能够接受、整合和传递信息。两个神经元之间或神经元与效应器细胞之间通过突触相互联系。为了识别影响突触特异性的新成分，Tong等[8]通过在果蝇眼睛中进行正向基因筛选，发现rich蛋白在突触形成识别过程中起作用。当rich蛋白缺失后，受体细胞中神经钙黏素会随之减少，此时神经元突触形成就缺乏了特异性。而Rab6蛋白能调节神经钙黏素的运输，当rich蛋白激活Rab6蛋白时，对突触正常的形成有影响。由此说明Rab6与果蝇视觉神经系统的发育过程有关。

Schlager等[30]发现BICD相关蛋白1(BICD-related protein 1, BICD-R1)也是Rab6的效应蛋白，同时是一个序列与BICD同源的蛋白，与神经元发育过程中囊泡的转运有关。在神经元分化早期，BICD-R1表达量很高，将Rab6分泌小泡聚集在中心体周围，既能阻止Rab6分泌小泡运输到神经突，又能防止神经元过早成熟。在神经元分化后期，BICD-R1表达量明显减少，允许Rab6分泌小泡顺行运输到神经突，促进神经元成熟。

科恩综合征相关蛋白-1(Cohen syndrome-associate protein 1, COH1)作为骨架蛋白在高尔基体功能及形态的维持中起重要作用。Seifert等[10]用小干扰RNA干扰Rab6A和Rab6A′表达时，发现干扰Rab6A和Rab6A′表达会阻止COH1定位到高尔基体上，说明COH1可能是Rab6的效应蛋白之一。此实验还证实单独降低COH1或Rab6的表达会影响神经系统的发育，说明在神经系统发育过程中Rab6 和CHO1起到了一定的作用。

3.3Rab6调控有丝分裂 细胞分裂有多种不同分裂方式，而有丝分裂是其中一种。真核细胞能通过有丝分裂产生体细胞。细胞有丝分裂是一个连续的过程，且具有周期性并受到严格的调控，整个分裂过程分为前期、中期、后期和末期。当敲除细胞中Rab6A′时，有丝分裂中期出现阻滞，说明有丝分裂的正常运行需要Rab6A′的参与。当Rab6A′功能异常时，Mad2作为纺锤体检查点蛋白被激活，导致有丝分裂在细胞中期停滞，说明Rab6A′能运输Mad2蛋白脱离着丝粒，使细胞分裂进程继续[7]。

Rab6 GAP CenA作为Rab6的效应蛋白，多数位于细胞质中，少数位于中心小体上，在细胞间期起作用，与胞质γ-微管蛋白形成复合体后，对微管的成核起到一定作用。Rab6A′能通过GTP酶激活蛋白互相作用参与细胞分裂中期到后期的转换[7,31]。

Rabkinesin6作为Rab6的驱动蛋白，分裂后期在纺锤体中部聚集，分裂末期聚集在溢裂沟和中间体上，在细胞分裂期表达量增多，与Rab6A相互作用参与细胞有丝分裂。Rabkinesin6过表达会引起细胞分裂缺陷，从而导致细胞死亡[32]。

有研究显示，Rab6不仅影响果蝇卵母细胞的极性，而且参与果蝇卵母细胞的发生，介导mRNA与细胞骨架的运输。Hou等[33]和Ma等[34]敲低小鼠卵母细胞中的Rab6A时，细胞培养发现，卵母细胞第一极体(pb1)排出率较对照组明显下降；激光共聚焦结果显示，Rab6A影响染色体的中板排列。由此推测Rab6A与卵母细胞减数分裂有关。此外，这些研究还证实Rab6A能够显著影响减数分裂过程中皮质颗粒和内质网的分布。由此推测，Rab6A的敲低可能通过影响囊泡向膜及内质网的运输，从而造成皮质颗粒和内质网异常。

4 Rab6与相关疾病

微RNA(microRNA，miRNA)在肿瘤近年的研究中受到了较多关注。miRNA发挥着类似癌基因和抑癌基因的作用，能调控个体的生长发育、细胞增殖和凋亡、细胞分化等各项生命活动。通过改变miR-5100 和miR-218的下游靶基因Rab6的表达，其能发挥抑癌基因的作用。Huang等[11]在肺癌细胞系A549和H1299中发现miR-5100表达明显增加，体外实验表明，过表达miR-5100会导致Rab6表达下降，从而促进细胞的增殖与克隆的形成。该实验还发现miR-5100与Rab6的3′非翻译区结合，导致Rab6表达下降，从而发挥致癌基因的作用。何龙等[35]在肾癌细胞系A498和769-P荷瘤裸鼠时发现，在裸鼠中过表达miR-218时，荷瘤后肿瘤的生长较慢，体重降低速度减慢。组织学检查发现，Rab6C的表达较对照组明显减少，说明miR-218能通过Rab6C调控肾癌细胞，且Rab6C与miR-218的表达呈负相关。

化疗耐药是目前恶性肿瘤临床治疗失败的主要原因之一。Rab6蛋白与肿瘤耐药相关。Shan等[20]研究发现，在多重耐药子宫肉瘤细胞株中，降低Rab6的表达，会增加对阿霉素的敏感性。但对HEK293细胞的研究发现，降低Rab6表达时，其对阿霉素的耐药性比野生型增高3～7倍，然而增加Rab6表达时却会促进HEK293细胞凋亡[36]。Tian等[37]从乳腺癌患者胸腔积液中分离的耐药细胞株及原代肿瘤细胞，在体外对Rab6C进行甲基化修饰，发现耐药的细胞株转为对化疗药物敏感的细胞系。近来在肺癌干细胞系A549和H1299研究中发现，miR-5100可以抑制Rab6的表达，从而降低对顺铂的敏感性[38]。

上述研究提示，在多种肿瘤研究中，Rab6的表达各有不同，但目前多数结果提示在肿瘤细胞中降低Rab6表达，能够促进肿瘤细胞的增殖和克隆[11,36,38]。但陈玉磊[39]为了探索Rab6蛋白是否对巨噬细胞分泌细胞因子产生影响，进而影响肿瘤的形成和发展，将巨噬细胞中的Rab6敲低后与肿瘤细胞共培养，结果显示巨噬细胞中的Rab6蛋白对肿瘤的迁移等过程无显著影响。由此，猜测Rab6蛋白可能对于肿瘤的形成与发展并没有直接关系。

阿尔茨海默病是累及中枢神经系统的神经元变性疾病，病理特征为神经元数目减少、β淀粉样蛋白沉积形成老年斑、神经元纤维缠结、海马锥体细胞颗粒空泡变性等[40]。McConlogue等[41]发现降低Rab6的表达会抑制β淀粉样蛋白的形成，说明Rab6与阿尔茨海默病之间存在某种联系。并且目前有研究发现，阿尔茨海默病患者脑中Rab6的表达量是正常人的5倍，Rab6与内质网应激之间存在一定关联，当阿尔茨海默病患者脑中Rab6表达下降时会激活内质网应激，但过表达会减弱内质网应激[42-43]。上述研究提示Rab6可能通过调控内质网应激的过程导致阿尔茨海默病的发生，具体机制有待进一步研究。

5 展 望

Rab蛋白通过与效应子结合完成囊泡在各细胞器间的转运，但这些效应蛋白如何在不同的细胞器上被识别，是否还有未发现的效应蛋白，Rab6除了在调控细胞自噬、影响神经系统的发育、调节有丝分裂方面起作用外，还有哪些功能仍有待进一步的探究。此外，Rab6蛋白不仅参与了多种肿瘤细胞的迁移、增殖、凋亡，信号转导以及药物耐受，并且在阿尔茨海默病患者中也起一定的作用，但Rab6蛋白在疾病发生及发展过程中的具体机制尚不清楚。因此，Rab6蛋白新的功能及作用机制仍有待于进一步探索。