慢性丙型肝炎患者外周血NK细胞的特点及直接抗病毒药物的影响

蒋瀚佶，封 波

(北京大学人民医院 北京大学肝病研究所 丙型肝炎和肝病免疫治疗北京市重点实验室，北京 100044)

慢性丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染是导致肝硬化、肝癌的重要原因之一。全球范围内约有71 000 000例HCV感染患者[1]。应用直接抗病毒药物(direct-acting antiviral agents，DAAs)治疗慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C，CHC)患者具有较高(>95%)的持续病毒学应答(sustained virological response，SVR)率以及较低的毒性，现已成为国际公认的CHC治疗的一线药物[2]。自然杀伤(natural killer，NK)细胞在人类肝脏(30%)及外周血(5%～20%)淋巴细胞中均大量存在，并在病毒性肝炎中显著增加[3]。NK细胞在抗病毒免疫应答中起重要作用，在慢性病毒感染中NK细胞的亚群分布、表型以及功能学指标发生显著改变[4]。与传统的α干扰素/利巴韦林治疗方案相比，DAAs通过抑制HCV的NS3蛋白酶、NS5A蛋白或NS5B聚合酶来抑制HCV复制，而对免疫系统无直接影响[5]。因此，研究应用DAAs治疗CHC过程中NK细胞亚群、表型以及功能的变化对于阐明NK细胞在慢性HCV感染中的作用具有重要意义。

1 HCV的病毒学特征及基因型

HCV属于黄病毒科丙型肝炎病毒属，是单股正链RNA病毒，长度约为9 600 bp。HCV RNA基因组具有5′端及3′端的非编码区。一个开放的阅读框被非编码区包围，并通过5′端的内部核糖体进入位点翻译成多聚蛋白。多聚蛋白被宿主及病毒蛋白酶裂解产生3种结构蛋白(core、E1、E2)与7种非结构蛋白(p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)。HCV核心蛋白形成包裹着RNA基因组的衣壳。E1、E2蛋白构成病毒的囊膜，包绕在核衣壳外。其他非结构蛋白不被整合进病毒颗粒中，但在病毒蛋白的加工以及基因组的复制中起重要作用。NS3-4A复合体是一种丝氨酸蛋白酶，用以裂解多聚蛋白形成独立的非结构蛋白。NS5B是病毒RNA复制所需的RNA聚合酶。NS5A是病毒复制以及病毒颗粒组装的调节蛋白[6]。DAAs通过抑制HCV的NS3-4A丝氨酸蛋白酶(telaprevir、boceprevir、simeprevir、asunaprevir等)、NS5B聚合酶(如sofosbuvir、dasabuvir)或NS5A蛋白(ledipasvir、ombitasvir、daclatasvir等)来抑制病毒的复制[6]。

HCV可以按不同基因型分类为7类[7]，除基因型5和7以外，其余基因型均可进一步分为不同亚型。不同基因型显示出不同的地理分布特征。一般，基因型1、2、3在全球范围内普遍流行，基因型4、5主要分布在非洲，基因型6主要在东南亚国家流行[2,7]。在中国，超过95%的HCV基因型属于以下5种主要亚型：1b、2a、3a、3b、6a。其中，大约75%的HCV感染属于基因型1b，其次为2a[8]。

2 慢性HCV感染患者NK细胞亚群、表型及功能的改变

NK细胞是人类机体抗病毒、抗肿瘤先天免疫的重要组成部分[9]。NK细胞可以产生细胞脱颗粒作用，释放穿孔素及颗粒酶来溶解病毒感染的细胞[10]。同时，NK细胞还可以通过肿瘤坏死因子相关的细胞凋亡诱导配体诱导靶细胞发生细胞凋亡[11]。除细胞毒性作用外，NK细胞还可以分泌许多具有抗病毒作用的细胞因子，如γ干扰素及肿瘤坏死因子-α[12]。

传统的NK细胞被定义为CD56+CD3-的淋巴细胞，并可以根据CD56的表达水平进一步分为CD56bright亚群和CD56dim亚群。最近，又有一群以CD56-CD3-CD16+为特点的NK细胞在慢性病毒感染中被发现，并定义为CD56neg亚群[13]。有研究表明，在CHC患者中，CD56bright亚群百分比升高，而CD56dim亚群百分比降低[14]。CD56neg亚群在正常人群中仅占整体NK细胞的5%左右，而在HCV感染后能升至10%～40%[4]。

NK细胞的活性和功能受许多抑制性和激活性受体的共同调控。抑制性受体包括NKG2A以及杀伤免疫球蛋白样受体等，可以下调病毒感染细胞表面的主要组织相容性复合体Ⅰ类分子，进而抑制NK细胞的杀伤作用。其他受体如NKG2C/D、NKp30、NKp44、NKp46等属于激活性受体，在HCV感染时可以传递激活信号，并将NK细胞诱导至活化状态[14]。对于CHC患者NK细胞表型的变化，不同研究得出的结果存在较大争议。有研究表明，在CHC患者外周血及肝内NK细胞表面，NKp46的表达水平显著上升[15]。NKp46高表达(NKp46high)NK细胞具有更高的细胞毒性以及γ干扰素分泌能力。NKp46highNK细胞在CHC患者肝组织中大量富集，并加强表达对HCV感染细胞及参与肝纤维化的肝星状细胞的杀伤能力[16]。其他NK细胞激活性受体，如NKG2D、NKG2C、NKp30、NKp44，也在慢性HCV感染患者NK细胞表面表达升高[15,17]。然而，仍有大量研究表明，CHC患者NK细胞表面激活性受体，如NKG2D、NKp30、NKp46的表达水平下调，而抑制性受体NKG2A及KLRG1表达水平升高[18]。

在慢性HCV感染过程中，NK细胞处于一种持续被激活的状态[15]。然而，并不是所有NK细胞的功能均增强。有研究表明，在慢性HCV感染过程中，NK细胞的杀伤作用增强，而γ干扰素分泌作用减弱[15,17]。慢性HCV感染导致内源性α干扰素增加，进而上调NK细胞信号转导及转录激活因子1(signal transducers and activators of transcription 1，STAT1)的表达水平。同时，积累的 α干扰素还会诱导STAT1优先磷酸化，而降低STAT4的磷酸化水平。磷酸化的STAT1(pSTAT1)会加强NK细胞的细胞杀伤作用，而缺少的pSTAT4则会减弱γ干扰素的分泌作用[19]。同时，仍有文献指出，CHC患者中NK细胞脱颗粒作用及肿瘤坏死因子相关的细胞凋亡诱导配体表达下降，而γ干扰素分泌能力增加[20]。

不同研究队列中，CHC患者NK细胞表型及功能的改变存在较大差异。目前出现这种差异的原因尚未研究清楚，但可能与患者数目及筛选方法的差异有关[12,21]。

3 HCV与NK细胞间的相互作用

HCV与NK细胞之间的直接或间接作用是导致NK细胞状态改变的主要原因。有研究表明，贴壁的E2病毒蛋白使NK细胞表面CD81交联，从而抑制NK细胞的效应功能[22]。贴壁的HCV颗粒同样也可以抑制NK细胞的功能，而游离的病毒颗粒却无此作用[23]。表明，HCV E2蛋白可以促进CD81交联，并抑制NK细胞功能。然而体外研究与体内环境有所不同，CD81交联需要HCV颗粒固定，并且需要达到很高的浓度，这些条件在体内很难满足。

除了HCV直接与NK细胞相互作用外，NK细胞与HCV感染的肝癌细胞直接接触会导致NK细胞功能的降低[24]。NK细胞在体外与HCV感染细胞接触后，NK细胞表面激活性受体NKG2D与NKp30表达水平下调，从而在体外抑制了NK细胞的功能与活性[25]。同时，被外源性α干扰素激活的NK细胞可以杀死HCV感染的肝癌细胞[26]。说明在研究NK细胞与HCV感染细胞间相互作用时，一些先天免疫细胞因子的作用不容忽视，包括α干扰素、β干扰素、白细胞介素(interleukin, IL)8、IL-12、IL-15、IL-18[27]。

由免疫辅助细胞产生的α干扰素及其他细胞因子可能会调控NK细胞与HCV感染的肝细胞间的相互作用。NK细胞被病原体激活需要辅助细胞分泌细胞因子协助，这类辅助细胞包括单核细胞、巨噬细胞、传统树突状细胞、浆细胞样树突状细胞等[28]。有研究表明，在肝脏中，Kupffer细胞可以作为辅助细胞察觉病毒RNA，并分泌一些细胞因子来间接激活NK细胞[29]。此外，辅助细胞在与HCV感染的肝癌细胞相互作用后还可以调节NK细胞的γ干扰素分泌能力。有研究表明，浆细胞样树突状细胞分泌的α干扰素可以激活NK细胞分泌γ干扰素[30]。说明，辅助细胞分泌的α干扰素也可以逆转HCV感染细胞对NK细胞产生的直接抑制作用。浆细胞样树突状细胞可以识别HCV感染细胞分泌的外泌体中的HCV RNA并释放Ⅰ类干扰素[31]。因此，HCV感染细胞、NK细胞以及浆细胞样树突状细胞之前的相互作用会对NK细胞同时产生激活性的以及抑制性的信号，而这两种信号间的平衡决定了NK细胞的激活状态。此外，还有文献报道，单核细胞接触HCV感染细胞后释放IL-18，IL-18激活NK细胞产生γ干扰素[32]。病毒NS5A蛋白通过Toll样受体-4刺激单核细胞分泌免疫抑制细胞因子IL-10，而抑制激活性细胞因子IL-12的分泌。IL-10会刺激 TGF-β 分泌的增加，TGF-β则会下调NK细胞表面NKG2D的表达水平。这些研究中的争论可能由于实验方法不同导致，有待进一步研究。

4 应用DAAs治疗对CHC患者NK细胞状态的影响

目前为止，关于DAAs治疗对CHC患者的免疫影响的研究还较少，结论尚存在很多争议。在DAAs治疗初期，NK细胞及各亚群百分比并无显著变化[33]。而在DAAs治疗较后期甚至停药后，NK细胞亚群、表型以及功能指标均有明显变化。有研究表明，CHC患者应用达卡他韦/阿舒瑞韦治疗方案时，在治疗第12周可以观察到CD56bright百分比显著降低，CD56dim百分比显著升高[8]。提示，在DAAs治疗过程中，NK细胞亚群的变化是一个由主要发挥细胞因子分泌及免疫调节作用的群体(即CD56bright亚群)逐渐向主要发挥细胞毒性作用的群体(即CD56dim亚群)的过程。同时，也有研究指出，在DAAs治疗过程中，NK细胞及各亚群的百分比并无显著变化[34]。

NK细胞表型及功能在DAAs治疗后期发生显著变化，使NK细胞整体的活化状态趋于正常化，即接近健康人群水平。有研究表明，CHC患者NK细胞表面HLA-DR、CD85j、NKp46、NKG2A显著高于健康人群，而在应用达卡他韦/阿舒瑞韦治疗方案第8周时，上述表面标志的表达水平均显著降低，呈现正常化趋势。与此同时，NK细胞脱颗粒能力，即pSTAT1、肿瘤坏死因子相关的细胞凋亡诱导配体的表达水平显著下降，而细胞因子分泌能力，即γ干扰素、肿瘤坏死因子-α的表达水平显著上升，显示出NK细胞的活化状态正常化[34]。也有相关文献指出，在DAAs治疗过程中，NKp30、NKp46以及NKG2A的表达水平呈线性下降趋势，并且在治疗第12周时与健康人群比较差异无统计学意义[14]。

此外，经过抗病毒治疗后，HCV感染引起的先天免疫应答激活状态被打破，体内干扰素的平衡状态得到修复，NK细胞对内源性干扰素的应答效应也显著提高[35]。

5 NK细胞状态的变化与DAAs应用中产生的临床问题

在应用DAAs治疗CHC患者过程中尚存在许多临床问题与争议，如HBV/HCV共感染患者HBV再激活问题、CHC患者再感染及肝癌复发风险增加的问题。研究DAAs治疗过程中先天免疫系统的改变对于解释并解决这些问题存在一定的指导意义。

由于乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)与HCV的传播途径相同，HBV/HCV共感染并不罕见，尤其是在静脉吸毒者、接受血液透析的患者、接受脏器移植的患者、人类免疫缺陷病毒阳性患者以及β-珠蛋白生成障碍性贫血患者等高危人群中[36]。与干扰素治疗类似，DAAs治疗也会引起HBV/HCV共感染患者的HBV再激活，严重程度从无肝炎的HBV再激活到需要进行肝移植的爆发性肝衰竭不等[37]。关于HBV/HCV共感染患者在接受DAAs治疗后发生HBV再激活的机制尚存在许多争议，与中国的研究不同[38]，日本学者研究表明，只有乙型表面抗原阳性的HBV/HCV共感染患者发生HBV再激活的风险较高，而乙型表面抗原阴性的共感染患者经过DAAs治疗后罕见HBV再激活[39]。

当患者同时感染HBV与HCV时，HCV往往占主导地位，表现为HCV载量高，而HBV DNA水平较低甚至无法检测。患者使用DAAs进行治疗后，HCV得到清除，两种病毒间的竞争被打破，使得HBV得以复制、再激活，并更具攻击性。同时，患者感染HCV时，免疫系统高度激活。当HCV清除后，患者的免疫系统活化状态降低，HBV可能得以逃逸、取代免疫系统的控制，发生HBV再激活[40]。NK细胞是机体先天免疫系统中重要的组成部分，NK细胞的表型、功能在HCV感染患者接受DAAs治疗后发生显著变化。目前尚无揭示NK细胞在HBV/HCV共感染患者接受抗病毒治疗后HBV再激活这一现象中的作用的报道。DAAs治疗不直接影响免疫系统功能[5]，是研究HBV/HCV共感染患者接受抗病毒治疗后HBV再激活的良好的模型。

另一个DAAs治疗过程中存在的问题与争议是CHC患者应用DAAs治疗后肝癌早期发生及复发风险的增加。HCV感染是全球范围内导致肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的主要原因之一[41]。使用干扰素/利巴韦林方案治疗CHC患者时，即使没有达到SVR，或HCC的发生风险没有被完全消除，也被大大降低[42]。而有研究指出，CHC患者接受DAAs治疗后发生HCC的风险增高[43]。同时，与干扰素/利巴韦林治疗方案不同，DAAs治疗无法降低曾患HCC患者的HCC复发风险[44]，甚至达到SVR的患者HCC复发风险更高[45]。因此，对于曾患HCC的患者，即使应用DAAs治疗CHC达到SVR，仍存在HCC复发的风险，需进行长期随访观察。而DAAs本身是否与HCC风险增加有关有待进一步研究[46]。然而，DAAs治疗后并不能增加CHC患者HCC早期发生与复发的风险[47]。对于DAAs治疗达到SVR的患者，HCC风险与基线的危险因素有关，而与DAAs治疗无关[48]。

关于DAAs可能引起HCC风险增加的机制尚无定论。传统的α干扰素/利巴韦林治疗方案对免疫系统具有显著的调节作用，干扰素的免疫调节作用与抗肿瘤作用可以对抗恶性细胞增殖，减少HCC的风险[49]。DAAs治疗方案则与之不同。有研究认为，应用DAAs快速治愈HCV感染会降低患者机体免疫监视水平，增加HCC的风险[50]。同时，有文献指出，DAAs治疗与HCV特异性的记忆性T细胞去分化、淋巴细胞失活以及NK细胞功能正常化相关，可能影响免疫系统对HCC的抵抗作用[14,34]。近期还有文献指出，患者治疗前NKG2D的表达水平以及治疗过程中的变化对HCC发生风险有预测价值[51]。研究DAAs治疗过程中NK细胞表型与功能的改变对于解释、阐明HCC发生与复发风险的改变有重要意义。

6 小 结

NK细胞是人体先天免疫系统的重要组成部分，在慢性HCV感染及后续的抗病毒治疗中NK细胞的表型与功能均发生显著变化。在DAAs治疗后期，NK细胞的整体活化状态趋于正常化，细胞毒作用显著下降，可能与HBV/HCV共感染患者HBV再激活、再感染以及HCC的发生与复发有关。与干扰素不同，DAAs直接作用于HCV的复制周期本身，尚未发现对免疫系统有直接影响。因此，DAAs是研究NK细胞在HCV感染中作用的一种有效手段。研究NK细胞在DAAs治疗过程中的变化对于解释、阐明HBV/HCV共感染患者HBV再激活以及HCC的发生与复发等DAAs治疗中的问题与争议有重要价值。