非酒精性脂肪性肝病发病机制研究进展——聚焦“巨噬细胞及其分子机制”

王晓晓，饶慧瑛，刘 峰

(北京大学人民医院 北京大学肝病研究所 丙型肝炎和肝病免疫治疗北京市重点实验室，北京 100044)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是包括非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver，NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)、肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌的一组疾病[1]。NAFLD的全球发病率约为24%，发病率最高的地区是南美(31%)和中东(32%)，其次是亚洲(27%)、美国(24%)和欧洲(23%)，且其发病率与肥胖和 2型糖尿病的发病率呈正相关[2]。NAFLD一旦进展至肝纤维化和肝硬化，肝脏相关疾病的死亡率将大大增加，因此NASH-肝硬化被认为是继慢性丙型肝炎后第2位常见的肝移植指征[3]。目前NAFLD的发病机制尚不清楚且无有效治疗措施，探讨NAFLD的发病机制进而寻找有效防治措施对解决NAFLD面临的经济负担至关重要。尽管研究认为“多重打击”学说已经能够比较完整地解释NAFLD的复杂性，但是天然免疫在其中扮演的重要角色仍没有完全阐明。现着重对巨噬细胞在NAFLD发生、发展中的重要作用进行论述。

1 传统意义上NASH的发病机制

1.1“二重打击”学说 早期研究人员用“二重打击”学说来解释NASH的发病机制。这一学说认为在疾病的起始阶段，肝脏脂肪沉积是第一重打击，表现为肝脏三酰甘油聚集和胰岛素抵抗，当肝脏受到其他因素(如炎症细胞因子大量释放、线粒体损伤和氧化应激等)带来的“二重打击”时会加重NASH的进展。脂肪变性的肝脏比较容易受到这些“二重打击”因素的影响，肝脏进一步进展为坏死性炎症和纤维化，并最终发展为肝硬化[4-5]。然而，随着研究的深入“二重打击”学说已不能全面揭示NAFLD发病机制的复杂性。在NAFLD的发生、发展中，有众多信号分子蛋白通路的参与，而且并不确定NASH仅是发生在NAFL的基础上。此外，对众多NAFLD患者而言，NAFLD发生的致病驱动基因并不总是一致的，导致疾病发生的机制和患者的临床表现具有高度的异质性[6]。

1.2“多重打击”学说 目前被广泛接受的是“多重打击”学说，由于遗传和环境因素的相互作用以及不同器官和组织(包括脂肪组织、胰腺、肠道和肝脏)之间的相互关联，“多重打击”学说将更广泛的代谢功能障碍机制囊括在内[7]。在NAFL和NASH背景下，肝脏处理主要代谢能量代谢物、碳水化合物和脂肪酸的能力受损，导致毒性脂类物质的堆积[8-9]。这些毒性脂类的堆积可诱导肝细胞氧化应激压力、损伤和死亡，导致纤维形成，并进一步导致肝硬化和肝细胞癌[10]。因此，肝细胞内脂类毒性物质是NASH发生、发展的关键。NASH时肝细胞损伤以内质网应激压力、炎性小体激活、凋亡通路激活等特点为主[11-13]。其他因素，如细胞因子和脂肪因子功能失调、ATP缺乏、尿酸毒性、睡眠呼吸暂停时的周期性缺氧以及肠道微生物的产物也可能参与调节肝细胞的脂毒性应激、损伤和炎症的发展，但对NASH发生、发展的影响尚不完全清楚[14]。而在NAFLD的发生、发展的众多影响因素(尤其是毒性脂类的堆积)中，天然免疫细胞激活的重要作用不容忽视。

2 天然免疫巨噬细胞与NAFLD发生、发展的相关性

肝脏是重要的免疫器官，肝脏的免疫功能主要归功于各种免疫细胞，包括巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞和肥大细胞等。巨噬细胞是肝脏天然免疫的第一道防线，在NAFLD的发生、发展中起关键作用。

在正常人的肝脏中，每100个肝细胞就有20～40个巨噬细胞伴随存在，是机体单核吞噬细胞中数量最多的细胞群体[15]。从细胞来源上讲，肝脏中巨噬细胞包括肝脏固有的巨噬细胞(Kupffer细胞)和单核细胞来源的巨噬细胞(monocyte-derived macrophages,MoMFs)。从细胞功能上讲，肝脏中巨噬细胞可分为M1型(促炎型)和M2型(抗炎型)巨噬细胞，两种细胞在抗炎和促纤维化方面各有不同。此外,根据巨噬细胞表面标志物的表达差异巨噬细胞也被赋予了不同的特点。

2.1“细胞来源”角度 肝脏中巨噬细胞是一种异质性的细胞群，包括肝脏固有的Kupffer细胞和从外周血招募进入肝脏的MoMFs。MoMFs主要通过CC趋化因子受体2(CC chemokine receptor 2，CCR2)-CC趋化因子配体2(CC chemokine ligand 2，CCL2)相互作用被招募进入肝脏[16]，其他趋化因子信号通路，如CXC趋化因子受体3-CXC趋化因子配体10、CCR1-CCL5或CCR8-CCL1也参与单核细胞的聚集[17-19]。在肝脏疾病或损伤状态下，单核细胞迅速分化为巨噬细胞，成为主要的巨噬细胞群，与真正的Kupffer细胞无法区分，但又不同于循环中的单核细胞[20]，这些巨噬细胞定位于肝窦内，能优先与外源性免疫反应物质或内源性信号分子接触，吞噬、加工和呈递抗原，并分泌多种促炎介质，如细胞因子、前列腺素、氧化氮和活性氧中间体[21]。

2.2“细胞功能”角度 为了保持稳定状态，巨噬细胞能对外界刺激物做出应答，极化为M1型(促炎型巨噬细胞)或M2型(抗炎型巨噬细胞)巨噬细胞亚型[22]。M1型巨噬细胞的功能是促进炎症细胞因子以及活性氧类的产生增加，而M2型巨噬细胞的主要功能为进行免疫调节、抑制寄生虫感染和加强组织重塑[23]。Kupffer细胞本身具有与M1型巨噬细胞相似的功能，可增加促炎细胞因子(如肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6等)的产生，促进肝脏疾病的进展，并通过分泌炎症细胞因子参与脂肪酸氧化、肝脏脂质储存和胰岛素抵抗等[24]。由此可见，巨噬细胞的不同极化状态可能参与NAFLD不同阶段的疾病进展。

2.2.1M1型巨噬细胞参与NAFLD肝脏炎症的进展 巨噬细胞在NASH发生、发展中起关键作用。一方面，巨噬细胞通过与由肝脏脂肪沉积产生的损伤相关分子模式相互作用促进NASH进展[15]。由于巨噬细胞具有吸收和代谢多余脂质的所有遗传机制，它们参与NASH的发病机制很可能与脂质累积有关[25]。如Leroux等[26]的研究已经证明，高脂饮食小鼠的Kupffer细胞中脂质沉积，这使脂质代谢通路相关基因的表达发生改变。另一方面，因为损伤相关分子模式和病原体相关分子模式的存在可导致促炎性肝脏巨噬细胞形成，进而参与NAFLD进展[27]。在NASH的炎症进展期，肝脏巨噬细胞以M1型为主，这可能是脂滴和非酯化脂肪酸过量刺激的结果[28]。肝脏促炎型巨噬细胞的极化被认为是NASH患者肝脏疾病进展的标志[29]。炎症性巨噬细胞可通过几种机制促进NASH的进展，包括影响肝细胞脂肪变、介导炎性淋巴细胞浸润、刺激血管生成或加重肝纤维化[30]。

2.2.2M2型巨噬细胞参与NAFLD肝脏纤维化的进展 虽然大多数研究表明M1型巨噬细胞在NAFLD发生中起重要作用[28-30]，但M2型巨噬细胞有助于阻止NAFLD时肝脏炎症的进展，并加重肝脏纤维化的形成[29]。在NASH患者中，肝纤维化是预测肝脏相关疾病总体死亡率的主要病理学特征[31]，其中一个主要原因是肝脏中与纤维化形成相关的M2型巨噬细胞显著增多[32]。Kupffer细胞或受损的肝细胞膜表面表达各种趋化因子受体的配体，循环中的单核细胞通过多种趋化因子受体与这些配体相互作用被招募进入肝脏[16,33]，浸润的单核细胞在特定刺激下可分化为M2型巨噬细胞，进而使肝星状细胞激活成为成纤维细胞，分泌细胞外基质，尤其是促进胶原的产生[34]。

尽管调节NAFLD疾病状态下M1/M2型巨噬细胞的比值可能是一种有效的治疗方法，但目前尚不清楚M1和M2型巨噬细胞是否代表完全独立的巨噬细胞群，如同时表达M1和M2两种细胞表型标志物的巨噬细胞属性将无法判断[1]。外源单核细胞可转化为肝脏固有的Kupffer细胞，又不同于Kupffer细胞，说明在NAFLD背景下肝脏巨噬细胞库至少包括3种不同的细胞群,但是目前仍无法明确区分肝脏固有的Kupffer细胞和外源的肝脏巨噬细胞[25,35]。

2.2.3不同表面标记的巨噬细胞与NAFLD进展的相关性 在NAFLD患者中，CCR2被认为是单核细胞来源的巨噬细胞的主要标志物，NAFLD的不同进展阶段都有CCR2+巨噬细胞的聚集，且主要存在于汇管区。在NASH-纤维化和肝硬化阶段CCR2+巨噬细胞显著增多，甚至可以浸润到肝小叶内[36]。S100A9+巨噬细胞是CCR2+巨噬细胞的一种促炎表型，随着NASH进展，S100A9+巨噬细胞数也显著增加[37]。CD68是一种溶酶体相关跨膜糖蛋白，参与低密度脂蛋白的代谢，是经典的Kupffer细胞表面标志物，CD68+巨噬细胞主要定位于肝小叶，在NASH的不同进展阶段不如CCR2+巨噬细胞变化明显。Kupffer细胞也表达CD163，是抗炎型巨噬细胞的标志物，在NASH纤维化或肝硬化患者中显著增多[36]。近年来，CLEC5A(C-type lectin domain family 5 member A)被认为是单核细胞来源的促炎型的巨噬细胞，CD163L(可溶性的CD163配体)也被认为是肝脏固有巨噬细胞的标志物，两种阳性细胞增多分别与肝脏炎症和纤维化进展相关[38]。在NAFLD小鼠模型的研究中，Ly6C+巨噬细胞被认为是单核细胞来源的巨噬细胞，其可在肝脏疾病情况下分化成Kupffer细胞，并加重脂肪性肝炎和纤维化[30]。

3 巨噬细胞参与NAFLD发生、发展的分子机制

3.1模式识别受体与NAFLD发生、发展的相关性 肝脏巨噬细胞可以通过激活模式识别受体促进免疫炎症反应。常见的模式识别受体有Toll样受体和清道夫受体等。在各种饮食诱导的NASH小鼠模型(如胆碱缺乏的氨基酸饮食、蛋氨酸/胆碱缺乏饮食和高脂饮食)中，多余的代谢产物(如胆固醇结晶、饱和脂肪酸)和相关氧化应激产物可激活膜表面Toll样受体(如Toll样受体2和Toll样受体4)，进一步促进核因子κB发生核转位，刺激肝脏炎症细胞因子的转录和合成[39]。在胆碱缺乏的氨基酸饮食和高脂饮食饮食诱导的NASH模型中，内质网Toll样受体蛋白(如Toll样受体9)可结合损伤肝细胞释放的线粒体DNA，并进一步加速炎症反应[39]。另外，高脂饮食和蛋氨酸/胆碱缺乏饮食诱导的NASH模小鼠型中，过量的代谢产物可激活并促进Kupffer细胞中Nod样受体蛋白3炎性小体复合物的组装，并进一步促进细胞因子的成熟和释放[40-41]。

Kupffer细胞的吞噬功能极强，能通过清道夫受体和溶酶体介导的吞噬功能从门静脉循环中清除微粒物质[42-44]。在营养过剩的情况下，过量的代谢物以及易位的细菌产物可以激活清道夫受体并引发促炎反应。如NASH时Kupffer细胞中清道夫受体(如CD36和清道夫受体-A)上调，清道夫受体上调可增加溶酶体中过量的氧化型低密度脂蛋白和胆固醇晶体的运输、积累和捕获，导致溶酶体损伤，进一步导致Kupffer细胞产生促炎症细胞因子[42-43]。

3.2补体激活参与NAFLD的发生、发展 肝细胞中巨噬细胞通过清除补体蛋白和释放细胞因子促进局部免疫反应。代谢压力下，Kupffer细胞释放大量细胞因子和趋化因子(如白细胞介素-1、肿瘤坏死因子-α、单核细胞趋化蛋白-1等)，这些细胞因子促进肝细胞产生和释放补体蛋白，当与循环中的病原体抗原结合后，补体蛋白被裂解成激活的补体片段。Kupffer细胞结合补体受体(如补体受体1、补体受体3、补体受体4等)并吞噬结合了病原体抗原的补体复合物，进一步加重严重反应[42-43]。

3.3干扰素基因激活蛋白(stimulator of interferon gene,STING)与NAFLD进展的相关性 STING是由379个氨基酸组成的具有4个跨膜区域的内质网跨膜蛋白[45-47]。STING是经典的天然免疫信号通路调节蛋白[45,48]。研究人员发现小鼠和人肝脏中STING的表达与NAFLD肝脏脂肪变和炎症相关，即STING在NAFLD的进展中起破坏作用[49-50]。从理论上来讲，肝细胞和巨噬细胞这两大类细胞会在NAFLD肝脏脂肪变和炎症的发生、发展中起重要作用。因此，肝细胞和(或)巨噬细胞中的STING可能参与NAFLD的进展。然而，多项研究发现人和小鼠的肝细胞不表达STING，STING仅在非实质细胞表达，尤其是在巨噬细胞表达[50-52]。

在蛋氨酸/胆碱缺乏饮食和高脂饮食小鼠模型的研究发现中，巨噬细胞中STING表达对营养过剩状态下NAFLD的进展是必要的。证据有以下两点：一方面敲除骨髓巨噬细胞中的STING，高脂饮食和蛋氨酸/胆碱缺乏饮食小鼠肝脏脂肪变和炎症程度比STING未敲除的小鼠模型明显减轻；另一方面仅敲除骨髓巨噬细胞的STING与STING完全敲除的小鼠模型相比，对NAFLD的损伤程度减轻相似[50,52]。除动物实验的证据外，NAFLD患者中，肝脏巨噬细胞中STING的表达也与NAFLD的进展相关[50]。这充分说明了天然免疫巨噬细胞中特异性的STING表达对NAFLD进展的重要性。这一作用可能的机制是STING的激活显著增加了巨噬细胞的促炎状态，分泌的细胞因子反过来又增加肝细胞的脂肪沉积和促炎反应，并增加肝星状细胞的活性，进而促进肝脏脂肪变、炎症甚至是纤维化的进展[50]。

4 小 结

不同研究者对NAFLD发病机制的解释多种多样，“多重打击”学说被认为是比较符合NAFLD发病机制复杂性的解释，这其中天然免疫又是参与NAFLD发生、发展不可或缺的部分。当机体脂质代谢平衡被打破时，过多脂类毒性物质的产生以及双链核酸的释放可影响巨噬细胞的迁移、聚集和极化。而模式识别受体、补体激活和STING作为主要的巨噬细胞蛋白分子促进NAFLD的发生、发展。这将为NAFLD细胞及分子生物学发病机制的研究提供新的方向。未来仍需探讨天然免疫信号通路的临床价值，并在具有不同临床体征的NAFLD患者(如肥胖或不肥胖，是否合并代谢综合征等)进行验证，为研究NAFLD的发病机制、寻找新的诊断治疗方案提供帮助。