PLGA纳米材料在缺血性脑卒中中的应用

郭 桥，蔡 强，李知阳，王文举，陈治标

(武汉大学第一临床学院 武汉大学人民医院神经外科，武汉430061)

脑卒中是脑部缺血或出血导致神经功能障碍的疾病，是引起死亡的第二大原因，常发生于老年群体，且有年轻化的趋势[1- 2]。我国脑卒中年发病约为200万，年新发病例约为150万，死于脑卒中的患者约130万，幸存者中75%不同程度地丧失劳动能力[3]。缺血性脑卒中又称为脑梗死，是由于栓子或血栓使脑部供血不足从而导致脑组织缺血缺氧引起脑组织与功能损伤的疾病，约占卒中人数的87%[3- 4]。静脉溶栓及机械取栓疗法是目前早期治疗缺血性脑卒中的主要方法，其时间窗及适用范围较窄[5]。只有5%的患者受益于重组组织型纤溶酶原激活剂治疗[6]。通过阻断导致神经元死亡的分子通路或增强神经元的存活和再生，已经开发出多种治疗脑卒中的药物，但除了重组组织型纤溶酶原激活剂外，其他很少在临床试验中成功[7]。由于现有很多药物存在溶解度低、半衰期短等药动学缺陷，在血脑屏障的存在下，药物很难到达脑组织损伤的部位，影响了药效的发挥[8]。新近发展的纳米技术可帮助药物显著扩大其药动学的局限性，在脑血管疾病的治疗中具有潜在的应用价值。纳米材料的粒径小，比表面积大(每克物质中所有颗粒总外表面之和)，并且能对其进行各种靶向修饰，改变其脂溶性等特性，适合作为脑部的载药系统，不仅能够装载疏水性或亲水性药物以及基因药物，还能成为影像学探针[9]。大脑局部缺血或损伤都会激活成年哺乳动物脑内的内源性神经发生[10]。利用纳米纤维作为神经细胞生长的支架和营造神经细胞生长分化的微环境，成为神经修复的热点。现就纳米聚乳酸- 羟基乙酸共聚物[poly(lactic- co- glycolic acid)，PLGA]纳米材料在缺血性脑卒中中的应用予以综述。

1 PLGA纳米材料应用于脑部给药

血脑屏障是生理性的屏障，存在于血液和脑组织之间，能够有效阻止血液内的有毒物质进入脑组织，保证脑组织处于相对稳定的微环境。同时也使得大部分药物难以进入脑组织发挥作用[7]。包括多肽和基因药物在内98%的小分子药物及大约100%的大分子药物是无法通过外周给药途径进入脑组织的[11]。缺血性脑卒中后7 d内虽然血脑屏障有所破坏通透性增加，但还远不能达到具有治疗效果的药物浓度，而传统的使药物进入脑的途径有经鼻给药；增加药物的脂溶性；破坏基膜的紧密连接蛋白使血脑屏障暂时打开等。但这几种途径也都有其各自的缺点：小分子药物通过增加脂溶性后可通过血脑屏障，但容易被血脑屏障上的外排泵及通道再次排出；活跃的射流泵或转运体，在大脑内皮细胞的腔膜高度表达，可以积极地将物质排回血流，进一步加强血脑屏障；P- 糖蛋白、多药耐药蛋白、腺苷三磷酸结合盒转运蛋白是最具特征的外排泵[12]；增加血脑屏障的通透性使药物进入脑的同时也增加了有毒物质进入脑的可能，从而导致其他损伤脑的疾病发生。因此，开发新的载药系统以更有效地将药物递送到脑损伤病灶区，已成为当前脑部疾病治疗领域的研究热点。

生物降解聚合物(天然聚合物和合成聚合物)是近年来生物医学治疗药物传递过程中最受欢迎的材料，它提供了靶向给药的靶点分布。聚合物的物理化学性质和降解性能可以很容易改变药物的控释和降解速率，不同聚合物的降解速率决定了哪种药物分子将被装载到交付过程中[13]。生物降解聚合物纳米粒(nanoparticles，NPs)材料主要分为合成生物可降解聚合物和天然大分子体系。聚生物降解聚合物包括乳酸、聚乙醇酸、PLGA、聚己内酯和聚乙二醇[poly(ethylene glycol)，PEG]；天然聚合物由壳聚糖、多糖、明胶、淀粉等组成。近年来，生物降解聚合物已广泛应用于缺血性脑卒中的治疗中，也是寡核苷酸、蛋白质和小分子药物递送系统的选择[7]。PLGA是由两种单体(乳酸和羟基乙酸)随机聚合而成的高分子有机聚合物，易合成，质量稳定，具有良好的生物相容性和生物可降解性，且无毒、无刺激性、无免疫原性，并具有较高的包封率，可将药物递送到病灶部位以实现可控性释放，已被美国食品药品管理局批准用于组织工程、医用材料、药物递送载体等领域[14]。PLGA NPs在体内可水解成乳酸和羧基乙酸两种单体，通过三羧酸循环最终代谢成二氧化碳和水，对人体不会产生不良反应。PLGA NPs颗粒粒径小，采用PLGA制成的纳米药物具有较高的细胞摄取率。Musumeci等[12]将奥卡西平包载入PLGA NPs中改进传统鼻腔给药治疗小鼠癫痫，结果显示对比传统鼻腔给药PLGA NPs包载药物的给药次数减少到1/24 h，并控制了大鼠的癫痫发作；免疫组织化学(抗- 神经丝、抗- 微管蛋白、抗- 胱天蛋白酶3)显示，奥卡西平PLGA NPs治疗16 d后具有神经保护作用。有研究表明，损伤的脑微血管内皮细胞过表达组织因子，融合蛋白增强绿色荧光蛋白- 表皮生长因子1可靶向该因子。Chen等[15]将负载组织因子- 增强绿色荧光蛋白- 表皮生长因子1- PLGA纳米颗粒作为靶向载体用于损伤的脑微血管内皮细胞，然后纳米颗粒对转录因子产生细胞内RNA进行干扰，研究结果表明，载组织因子- 增强绿色荧光蛋白- 表皮生长因子1毒性最小，转染24 h后，几乎96%的细胞存活，而脂质体转染的细胞只有75%存活。主要的PLGA NPs的制备方法有复乳溶剂蒸发法、纳米粒沉淀法等。制备方法的不同影响着其粒径的大小和包载率，其中采用复乳溶剂蒸发法所获得的纳米粒的粒径较小，且有良好的稳定性和生物相容性[16]，而纳米粒子的体积/表面积比例会随着纳米粒粒径的大小而变化，大分子纳米微粒载药较多但释放药物不均匀，不彻底。 Cruz等[17]用脑损伤的小鼠模型证明了PLGA NPs大小是决定其到达脑损伤区能力的关键因素。有治疗效果的神经保护药物已很多，进一步改进PLGA纳米材料作为药物载体的性质，使治疗药物达到缺血性脑损伤部位，实现口服给药甚至局部给药是将来的发展方向。

2 PLGA纳米材料应用于缺血性脑卒中的药物治疗

导致脑组织损伤的病理生理机制包括兴奋性毒性、钙超载、自由基损伤、炎症反应以及神经元凋亡等。由于很难达到脑损伤部位，故大多数药物在临床中效果不显著。Mukherjee等[18]将姜黄素结合PEG化的PLGA纳米颗粒，给老年大鼠口服，结果显示活性氧类标志物及损伤面积比只给姜黄素的对照组明显减少。PLGA载体增加了姜黄素的生物可降解性，增加了脑内的药物浓度。Gao等[13]将纳米氧化铈包裹在PLGA- PEG共聚物基质上，与对照组相比，制备的氧化铈纳米颗粒联合PEG/PLGA基质具有更好的疗效，使局部缺血减少60%，脑水肿减少78%。将传统的神经保护药物搭载在PLGA NPs上确能增加药物治疗缺血性脑卒中的疗效，这主要是因为搭载药物的PLGA NPs能通过血脑屏障，增加药物在脑组织的浓度。但目前的研究主要还是动物实验，Mdzinarishvili等[19]利用PLGA- PEG包裹三碘甲腺原氨酸通过颈静脉给药，证明在缺血性脑卒中模型中注射PLGA- PEG- 三碘甲腺原氨酸溶液比单独注射三碘甲腺原氨酸具有更好的疗效。Chaturvedi等[20]利用PLGA搭载基质金属蛋白酶组织抑制物1可起到药物缓释作用，结果显示，较单独使用金属蛋白酶组织抑制物1有显著的神经保护作用。除了将药物搭载在PLGA上，NPs表面工程还可增强纳米载药系统的靶向性，提高溶解度，延长半衰期，降低免疫原性，改善生物分布。多数研究在使用PLGA时多利用PEG涂层，PLGA NPs表面覆盖PEG脂质层，以减少非特异性结合，提高血液半衰期，并允许特定配体的结合，而通过不同的PLGA 表面修饰可达到靶向损伤部位和不同治疗目的的效果[15,19- 20]。另外，还可将纳米颗粒装载在生物载体内(如酵母衣壳和巨噬细胞)，实现口服给药或靶向目的。Pang等[21]通过与M1型巨噬细胞共孵育PLGA纳米颗粒制备M1型巨噬细胞负载纳米颗粒治疗脑胶质瘤，M1型巨噬细胞在颗粒加载后仍保持良好的肿瘤趋向性，能够有效地使颗粒穿过内皮屏障进入肿瘤组织。纳米材料能跨过血脑屏障是治疗缺血性脑卒中的首要部分，而实现药物准确而有效地靶向损伤脑组织达到治疗效果，还需要进一步研究发现有效的配体或生物载体。

3 PLGA纳米材料应用于缺血性脑卒中后的组织修复

替代因脑卒中而失去的脑组织仍然是一个重大挑战。脑卒中后的功能障碍是由神经元死亡引起的，因此，替代这些丢失的神经元有可能逆转功能障碍。神经干细胞植入大脑后可以分化为神经元，神经元整合到剩余的宿主大脑，并通过整合到现有的神经网络和(或)通过刺激血管生成进而改善神经功能，而促进一些行为恢复。但神经干细胞的分化和功能的完善需要一定的微环境和基质支持。在胎儿和成人组织中，细胞外基质约占脑容量的20%[22]。将人神经干细胞与去细胞化细胞外基质生物支架结合，也可实现神经干细胞在病变腔内的高效分布。Bible等[23]利用在释放血管内皮生长因子的PLGA微粒上植入人神经干细胞，与去细胞化细胞外基质生物支架结合，可以促进微血管的形成，为新生组织的生长提供氧气和营养。微环境决定着神经干细胞的分化生长。Ropper等[24]的研究利用PLGA制成的支架和人间充质干细胞治疗大鼠脊髓损伤模型，使成年大鼠脊髓损伤后的运动感觉得到明显改善，疼痛和组织损伤得到缓解，髓鞘得以保存。该研究将人神经干细胞播种在设计独特的PLGA 基质中，以提高供体干细胞在非分化状态和局部移植中的存活率，从而促进植入- 宿主在体内的相互作用，对于缺血性脑卒中的神经修复具有启示意义。Ju等[25]用透明质酸为基础的可生物降解水凝胶支架，与含有血管内皮生长因子和血管生成素1 的PLGA微球混合制成的生物材料复合材料植入大脑的损伤区域，在体外实验中发现人脐动脉内皮细胞和神经干细胞在体外PLGA微球透明质酸水凝胶上具有良好的存活和增殖能力；该新材料植入小鼠正常或缺血脑后，与脑组织具有良好的相容性，小鼠模型明显表现出行为改善。以往认为神经干细胞发生只存在于胚胎发育过程中，而成人的中枢神经系统不能产生新的神经元。但近年来的研究发现，在成年哺乳动物中枢神经系统存在着神经干细胞聚集区，脑组织缺血及损伤会激活内源性神经干细胞的分化，这种神经发生主要存在于脑室管膜室下区和海马齿状回的颗粒层下区两个神经源性脑区[9]。Petro等[26]利用PLGA包载抗氧化剂过氧化氢酶和超氧化物歧化酶治疗缺血性脑卒中模型小鼠，促进内源性神经干细胞的发生。Wang等[22]将表皮生长因子和促红细胞生成素封装在PLGA NPs和聚癸二酸涂层组成的两相微粒子中治疗缺血性脑卒中模型小鼠，结果发现NPs成功穿过血脑屏障，并促进内源性神经干细胞的分化，小鼠神经功能有显著的恢复。组织工程和细胞工程的发展对于缺血性脑卒中以及其他脑部损伤疾病的神经功能恢复相当重要。PLGA纳米材料良好的生物相容性对于应用脑损伤组织修复有进一步的研究价值。

4 PLGA纳米材料用于缺血性脑卒中的影像诊断

缺血性脑卒中和其他许多颅脑疾病一样，有炎症反应、氧化应激、细胞凋亡等过程的参与。Guo等[27]报道了一种功能化环糊精制备的髓过氧化物酶的合成和表征，以该功能材料为基础的纳米粒子，在炎症条件下，活性氧和髓过氧化物酶异常升高，激发出明显的高、可持续的发光信号；利用这种纳米探针可以选择性地成像炎症反应中激活的中性粒细胞，其发光信号与中性粒细胞计数呈正相关，且这种纳米探针能够在体内精确定量和跟踪各种炎性疾病。将纳米微粒载体配上相应的配体(如修饰抗中枢神经系统损伤的生物标志物——S100钙结合蛋白B、血管细胞黏附分子、胶质原纤维酸性蛋白等)，利用计算机断层扫描或磁共振成像可以快速检测出损伤部位和范围[28]。Cruz等[17]将一种800 CW的蓝色染料结合到PEG- PLGA NPs上，利用NPs的穿透性和800 CW能与死亡细胞蛋白结合的能力，达到靶向标记脑损伤部位的目的。临床使用的各种溶栓药物血浆半衰期短、靶向性低、易引起出血等并发症，因此早期发现血栓、局部溶栓治疗是有吸引力的。Zhou等[29]的Fe3O4型PLGA NPs体外和体内实验均证实，该NPs特异性地积聚在血栓边缘，具有显著的溶栓作用，证明了NPs作为一种双功能工具在血栓早期检测和磁共振成像溶栓效率动态监测中的潜力。缺血半暗带的成像，挽救更多的脑组织是早期影像诊断的目的，PLGA纳米探针的准确性还需要进一步提高，这需要找到合适的标志物。

5 小 结

PLGA作为生物材料植入脑组织的研究较少，无论是利用内源性还是外源性干细胞替代缺损组织，都需要良好的微环境，PLGA具有很好的利用价值。随着纳米技术的发展及分子探针在影像学中的应用，影像医学已从对传统的解剖和生理功能深入到分子水平成像。PLGA可作为在活体状态下从细胞和分子水平对生物过程进行可视化的定性和定量研究的探针的良好载体。缺血性脑卒中的诊断和治疗对时间的要求很高，早期诊断和治疗决定着患者的预后，脑卒中后有7d窗口期，此间血脑屏障通透性增强利于输送药物，但这对于达到治疗效果还不够。有效的神经保护药物必须能在通过外周和其他中枢神经系统屏障后仍然保持其特性，并且能在血脑屏障功能逐渐恢复或完好时有效地通过血脑屏障达到病灶，PLGA纳米材料有望成为缺血性脑卒中的诊疗工具。