花期高温胁迫下TaERECTA基因对小麦生理特性和光合作用的影响

郑甲成，尤依锦，刘 婷，徐 祥，李杰勤，王 歆，程昕昕，许 峰，詹秋文

(安徽科技学院农学院，安徽凤阳 233100)

黄淮海地区是小麦的主产区之一，在小麦生长季节尤其是生育后期(开花期和灌浆期)，经常出现干热风等高温天气，出现“高温逼熟”严重灾害，导致小麦籽粒产量下降和品质变劣。ERECTA是分离自拟南芥的类受体激酶(RLKs)，主要参与植物的细胞分裂和组织发育[1]。ERECTA参与调控拟南芥AS1/AS2基因信号通路中叶片上下表皮极性发育进程，降低拟南芥植株对热胁迫的敏感性[2]。在拟南芥、番茄和水稻中分别过量表达ERECTA基因后，转基因株系耐热性显著增加，而拟南芥er突变体对热胁迫敏感[3]。小麦是全球最重要的粮食作物之一，世界上40%的人口以小麦为主粮[4]。因此，研究小麦TaERECTA基因提高小麦耐热性的生理机制，对改良黄淮海地区小麦耐热性、培育耐热性小麦新品种具有重要意义。

小麦属于喜凉作物，高温对整个生育期都会产生影响，但以抽穗扬花期最敏感[5]。高温胁迫会导致小麦产生大量活性氧，丙二醛(MDA)含量增加，膜脂过氧化加剧，植株功能期缩短，甚至死亡[6]。超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)等被认为是清除植物体内活性氧的主要抗氧化物质，可使植物对胁迫产生一定的耐受力[7]。相对电导率(relative electrical conductivity,REC)是评价植物遭受逆境胁迫时电解质外渗率的重要指标，可以反映逆境胁迫对植物细胞膜的损坏程度[8]。本研究以T3代转TaERECTA基因小麦为材料，在扬花期(Z65)[9]进行高温胁迫处理，测定其抗氧化酶活性、REC、MDA含量等，以及扬花期的相关光合参数，以明确TaERECTA基因在小麦开花期调控耐热性的生理机制。

1 材料与方法

1.1 试验材料

转TaERECTA基因小麦株系的选育在英国洛桑研究所的小麦遗传转化平台完成，受体为半冬性小麦品种Cadenza。于2015、2016和2017年对转TaERECTA基因小麦的T0、T1和T2代，连续进行PCR阳性检测和过表达鉴定，获得稳定遗传的30个小麦单株(分为12个转基因小麦株系)。2017年11月，通过盆栽方式将对照株系(CK，转Bar基因)、野生型株系(WT)以及3个超表达水平稳定的转基因小麦株系L3、L6和L15种植于安徽科技学院隔离室。

1.2 T3代转基因材料中TaERECTA基因的超表达分析

通过试剂盒(天根，北京)提取转基因小麦幼苗的总RNA，并反转录合成cDNA(TaKaRa，日本)。采用半定量和实时定量(qRT-PCR)方法同时检测TaERECTA的超表达水平。内参基因TaActin的引物为TaActin-F：TTGCTGACCGT ATGAGCAAG和TaActin-R：ACCCTCCAAT CCAGACACTG；目标基因TaERECTA的引物为TaERECTAQ-F：CAACGAGTACGTGAGC CTGCG和TaERECTAQ-R：GACTGACTACC TGCTTGCTGCATC。半定量和定量的实施步骤、数据分析参见Zheng等[10-11]的方法。

1.3 转基因株系高温胁迫处理

参照国际小麦生育期的划分标准[9]设定小麦取样生育时期和取样日期。在抽穗前期(Z49)，将各株系移至光照培养室(室温22～25 ℃，白天光照16 h，光强525 μmol·s-1·m-2，夜间暗培养8 h)培养1周，每个株系种植4盆，每盆2株。于扬花中期(Z65)[9]9:00开始进行40 ℃高温胁迫处理，分别在处理的1、2、3、4和5 h取样测定相关生理指标。

1.4 小麦生理指标的测定

选择小麦倒二叶进行生理指标测定。超氧化物酶(SOD)活性测定采用氮蓝四唑(NBT)法[12]，过氧化物酶(POD)活性测定采用愈创木酚显色法[13]，过氧化氢酶(CAT)活性测定采用紫外吸收比色法[14]，丙二醛(MDA)含量测定采用硫代巴比妥酸法[15]，相对含水量(RWC)测定参照黄芬肖等[16]的方法，相对电导率(REC)测定参照张宪政[17]的方法。

1.5 光合作用参数的测定

扬花中期(Z65)[9]高温胁迫处理5h后，将各株系移回光照培养室，继续培养3 d后，在早晨9:00-11:00，用光合仪(美国, Li-6400)测定胁迫后小麦植株旗叶的光合速率、气孔导度、蒸腾速率和胞间CO2浓度。温室内采用内置光源，光强设定1 000 μmol·m-2·s-1，CO2参比浓度为400 μmol·mol-1，相对湿度为50%～70%，气室温度为25 ℃。每株系测定6个单株。同时，高温胁迫后测定小麦植株的SPAD值，测定方法参照仪器(SPAD-502plus，Minoda)说明书，每株系测定6个单株。

1.6 数据处理与制图

采用Microsoft Excel 2010、SPSS 18.0进行数据处理、差异显著性分析及图表绘制。

2 结果与分析

2.1 转基因小麦超表达水平稳定性分析

qRT-PCR分析结果(图1A)显示，3个转基因小麦株系(L3、L6和L15)中，TaERECTA基因的表达水平均极显著(P<0.001)增加，分别为CK株系的9.5倍、6.1倍和9.9倍，而内参基因TaActin的表达水平在各株系间无显著差异。半定量分析结果(图1B)显示，TaERECTA在转基因株系中电泳带型明亮，在CK株系和WT株系中电泳带型微弱，而内参基因TaActin在各株系中电泳带型亮度一致，无明显差异，此结果与qRT-PCR结果一致，进一步证实TaERECTA基因在转基因小麦株系中均可以稳定超表达。说明TaERECTA基因转入小麦可以显著增加其在小麦中的转录水平。

2.2 扬花期高温胁迫对转基因小麦抗氧化酶活性的影响

由表1可知，高温胁迫下3个转基因株系的SOD活性均较高，胁迫1、2、4和5 h后，3个转基因株系的SOD活性均显著(P<0.05)高于野生型株系。高温胁迫1 h后，L3和L6株系的SOD活性显著高于CK株系(P<0.05)；高温胁迫2、3和5 h 后，L15株系的SOD活性均显著高于CK株系(P<0.05)；胁迫4 h后，L6株系的SOD活性显著高于CK株系(P<0.05)。

由表2可知，高温胁迫处理下，3个转基因株系的POD活性基本上都显著高于野生型株系和CK株系(P<0.05)，其中，胁迫1 h后，转基因株系L3和L15的POD活性分别较CK株系高24%和45%；高温胁迫处理2、3和4 h后，3个转基因株系的POD活性平均值分别较CK株系高24%、49%和63%；而处理5 h后，L3和L6株系的POD活性分别较CK株系高18%和59%。

由表3可知，不同处理时间段内，3个转基因株系的CAT活性均显著高于野生型株系和CK株系(P<0.05)。高温胁迫处理1、2、3、4和5 h后，3个转基因株系的CAT活性平均值分别较CK株系高68%、42%、53%、59%和24%，差异均达到显著水平(P<0.05)。

植物体内的SOD、POD和CAT对清除活性氧有重要作用，可使植物对高温胁迫产生一定的抵抗力。在扬花期高温胁迫下，转TaERECTA基因小麦具有较高的SOD、POD和CAT活性，说明TaERECTA基因在小麦中超表达对小麦的耐热性有一定的调控作用。

WT：野生型小麦；CK：转bar基因的对照株系； L3、L6和L15：转TaERECTA基因株系；***表示与对照之间有极显著差异(P<0.001)。下同。

WT:Wild type of Cadenza; CK:Thebartransgenic plants; L3,L6 and L15:TaERECTAtransgenic plants; *** means significant difference between transgenic lines and control at 0.001 level.The same in other figures and tables.

图1转基因小麦株系中TaERECTA基因超表达水平的qRT-PCR分析(A)和半定量分析(B)结果

Fig.1qRT-PCRandRT-PCRanalysisofTaERECTAgeneoverexpressionintransgenicwheatlines

2.3 扬花期高温胁迫对转基因小麦叶片膜透性的影响

表1高温胁迫下转基因小麦的SOD活性

Table1SODactivityoftransgenicwheatlinesunderhigh-temperaturestress

U·g-1FW·min-1

同列数据后小写字母不同表示在0.05水平差异显著(P<0.05)。下同。

The lower-case letters in the same column indicate significant difference at 0.05 level. The same in tables 2～4.

表2 高温胁迫下转基因小麦的POD活性

表3 高温胁迫下转基因小麦的CAT活性

表4 高温胁迫下转基因小麦的MDA含量Table 4 MDA content in transgenic wheat lines under high-temperature stress μmol·g-1 FW

MDA是植物器官在遭受逆境或衰老时脂膜过氧化作用的产物之一，通常把它作为脂膜过氧化的指标，用以反映细胞脂膜过氧化程度和植物对逆境响应的强弱[18]。由表4可知，高温胁迫下，各小麦叶片的MDA含量整体呈先增后降的变化趋势。在高温胁迫处理1～4 h后，3个转基因株系的MDA含量均显著低于野生型株系(P<0.05)；且高温胁迫1、2和4 h 后，L3、L6和L15株系的MDA含量平均值分别较CK株系低22%、39%和31%，差异达到显著水平(P<0.05)，而高温胁迫3 h和5 h后，仅L6株系的MDA含量与CK株系间的差异达到显著水平(P<0.05)。

高温经常伴随植物体内水分散失和叶片卷曲。本研究中，随高温胁迫时间延长，小麦植株的相对水分含量(RWC)呈降低趋势。胁迫3 h后，小麦各株系叶片卷曲严重，个别植株底部叶片出现枯死，株系间RWC差异不明显，故本文只分析了高温胁迫3 h以内RWC的变化。由图2可知，胁迫1 h后，仅L3株系的RWC与CK株系间的差异达到显著水平(P<0.05)；胁迫2 h后，L3、L6和L15株系的RWC均显著(P<0.01)高于CK株系； 胁迫3 h后，各小麦株系的RWC均明显降低，仅L6转基因株系的RWC显著高于CK(P<0.05)。说明短时间高温胁迫下， 转TaERECTA基因小麦具有较高的相对水分含量。

相对电导率是评价细胞膜透性的有效方法。有研究表明，小麦叶片在高温胁迫71 min后，相对电导率达50%，植物组织就已经死亡[8]，故本研究只检测了高温胁迫30、60和120 min后小麦叶片相对电导率的变化情况。由图3可知，高温胁迫下，转基因小麦的REC明显低于CK株系。高温胁迫30 min后， L3和L15株系的REC显著低于对照株系(P<0.05)；60 min后，L6和L15株系的REC分别显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)低于对照株系；120 min后，L3和L5株系的REC极显著低于CK株系(P<0.01)，而L6株系的REC显著低于CK株系(P<0.05)。说明高温胁迫下，转基因小麦脂膜的损伤较小，这与MDA测定显示的结果基本一致。

同一处理时间段图柱上的*和**分别表示转基因小麦株系与对照(CK)株系间在0.05和0.01水平上差异显著。图3同。

* and ** in the same treatment stage indicate significant difference between transgenic lines and control at 0.05 and 0.01 levels,respectively.The same in figure 3.

图2高温胁迫下转基因小麦的相对含水量

Fig.2Relativewatercontentintransgenicwheatlinesunderhigh-temperaturestress

图3 高温胁迫下转基因小麦的相对电导率

2.4 扬花期高温胁迫对转基因小麦SPAD值及光合作用参数的影响

高温胁迫能影响小麦叶片叶绿素的合成。由图4可知，随高温胁迫时间延长，各处理小麦叶片的SPAD值整体呈下降趋势，但转TaERECTA基因株系的SPAD与CK株系间的差异均未达到显著水平(P>0.05)。说明高温胁迫下，TaERECTA基因对小麦叶绿素含量无明显影响。

由表5可知，在扬花期高温胁迫5 h后，与对照(CK)株系相比，转基因小麦L3、L6和L15株系的光合速率(A)分别较CK株系增加35%、33%和51%，而三个转基因株系瞬时水分利用效率分别较CK株系增加53%、67%和47%，差异均达到极显著水平(P<0.01),胞间CO2浓度(Ci)和蒸腾速率(Tr)在转基因株系中均降低，仅有L6株系与CK株系间差异达到显著水平(P<0.05)。气孔导度(Gs)在转基因株系和CK株系间无显著差异。这说明TaERECTA基因过表达可以显著提高小麦的光合速率和瞬时水分利用效率。

图4 高温胁迫下转基因小麦的SPAD值

小麦株系Wheat line高温胁迫下转基因小麦的光合参数Photosynthetic parameters of transgenic wheat lines under high-temperature stress光合速率A/(μmol·m-2·s-1)气孔导度Gs/(mmol·m-2·s-1)胞间CO2浓度Ci /(μmol·mol-1)蒸腾速率Tr/(mmol·m-2·s-1) 瞬时水分利用效率 WUEi/(μmol·mmol-1)WT12.77±0.310.12±0.01204.89±17.072.83±0.324.52±0.05CK13.74±0.200.20±0.01266.71±11.403.87±0.233.66±0.11L318.48±0.34∗∗0.18±0.01215.81±7.643.30±0.475.61±0.03∗∗L618.29±0.57∗∗0.16±0.00183.45±8.01∗2.99±0.39∗6.12±0.39∗∗L1520.78±0.46∗∗0.23±0.00233.53±1.553.75±0.285.37±0.15∗∗

表中同列数据后*和**分别表示转基因小麦株系与对照(CK)株系间在0.05和0.01水平上差异显著。

* and ** in the same column indicate significant difference between transgenic lines and control at 0.05 and 0.01 levels,respectively.

3 讨 论

本研究表明，花期高温胁迫下，转TaERECTA基因的小麦株系叶片中SOD、POD和CAT活性明显高于CK株系，暗示转TaERECTA基因小麦活性氧的清除能力较强。TaERECTA基因参与调控植物细胞内电子传递链[19]，推测可能会影响细胞内SOD活性，提高小麦耐热性，但其具体机理还需进一步研究。

本研究表明，高温胁迫导致小麦叶片的MDA含量和REC迅速增加，说明高温胁迫打破了小麦叶片自由基产生和清除的动态平衡，使膜脂过氧化程度加剧，质膜透性加大，电解质外渗；本研究还显示，高温胁迫3 h后各株系小麦叶片RWC迅速降低，说明随高温胁迫时间延长，蒸腾速率升高，小麦叶片RWC迅速减少。与CK株系相比，转TaERECTA基因小麦的MDA含量相对较低，两者之间差异显著；同时， 转TaERECTA基因小麦的REC也较低，且随胁迫时间延长，与CK株系间的差异更加明显。高温胁迫2 h后，转TaERECTA基因小麦的RWC极显著高于CK株系，但随高温延续，小麦蒸腾速率加快，此差异逐渐消失。说明高温胁迫下TaERECTA基因可能参与调控细胞膜结构的相对稳定性，减少细胞内容物外渗，降低高温对叶片的伤害。

ERECTA基因在拟南芥、水稻和番茄中超量表达后，能够显著提高植株的耐热性，而拟南芥er突变体植株中H2O2含量较高，对热胁迫特别敏感，推测是由于ERECTA可以保护细胞膜免受高温胁迫引起的细胞损伤和细胞死亡，保护脂膜的完整性[3]。本研究表明TaERECTA基因可能参与调控小麦细胞膜的稳定性。然而，关于ERECTA通过调控作物光合电子传递和呼吸电子传递，影响逆境下细胞膜稳定，提高作物耐热性的分子机制却没有报道，也缺乏ERECTA基因在高温胁迫下降低作物叶片细胞等离子膜发生起泡、褶皱、质壁分离等损害的直接证据，这些均亟待后续研究。

高温胁迫5 h后，转TaERECTA基因小麦的A和WUEi均显著高于CK株系，说明高温胁迫下TaERECTA超表达可以提高小麦的光合能力，这与前期转TaERECTA基因小麦在正常条件下具有较高光合效率的研究结果一致。小麦光合作用变化既受气孔因素影响也受非气孔因素影响，Ci和Gs均降低导致光合作用下降主要是由气孔因素引起的，而Ci升高和Gs下降则是非气孔因素引起的[20]，高温胁迫下转TaERECTA基因小麦光合较低主要是由非气孔因素引起，进一步补充说明TaERECTA基因功能与拟南芥ERECTA家族成员不同，并不是通过调控小麦叶片的气孔发育途径来提高小麦耐热性，应该有其他独立的调控通路。