红景天苷对血管性痴呆大鼠学习记忆能力的改善作用及机制研究

王金华 张叶青 陶涛涛 柯博熙 张丹红

血管性痴呆（vascular dementia，VD）是由各种心、脑血管疾病导致的一种常见的临床综合征，患者主要表现为渐进性的认知功能下降[1]。近年来，VD发病率呈上升趋势，已成为仅次于阿尔茨海默病的第二常见的痴呆类型[2]。目前，对于VD仍没有特效的治疗方法。红景天苷是从传统中药红景天中提取出来的一种化合物，具有多种药物活性，如改善缺氧状态、抗肿瘤、抗疲劳和抗毒性等作用[3-7]。同时，大量研究证实红景天苷对于不同痴呆模型相关的认知功能具有明显的改善作用[8-9]，但其作用机制仍不明确。本实验采用双侧颈总动脉结扎法制作VD模型，并通过水迷宫实验检测大鼠认知功能的变化来评价红景天苷对VD大鼠的治疗效果，并探讨其潜在机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物 选取雄性健康SPF级SD大鼠42只，体重230～280g，由河北医科大学实验动物中心提供。动物饲养在屏障环境内，动物房环境噪音低于60dB，室温控制在20～25°C，相对湿度50%～70%，给予动物12h光照/12h黑暗交替的环境。所有动物自由获取食物与饮用水。所有动物操作均严格遵守国际动物保护与使用指南的相关规定。

1.2 主要仪器和试剂 Morris水迷宫检测系统购自上海欣软信息科技有限公司，红景天苷（ab120899，1mg），超氧化物歧化酶（SOD）（ab65354）、丙二醛（MDA）（ab118970）、TNF-α（ab100785）、IL-6（ab234570）ELISA试剂盒均购自英国Abcam公司。

1.3 大鼠VD模型建立 采用随机数字表法将大鼠分为对照组、模型组和红景天苷组3组，对照组大鼠12只，模型组和红景天苷组各15只。模型组和红景天苷组采用双侧颈总动脉结扎法制作VD模型，具体操作如下：每只大鼠于手术前12h开始禁食，可进水。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，麻醉剂发挥效果后将大鼠固定于操作台上，消毒后沿颈部正中切开皮肤，显露大鼠双侧颈总动脉，分离周围组织后进行双侧颈总动脉结扎。术后对皮肤进行缝合并再次消毒，将动物放入笼中室温下自然苏醒，正常进食水。对照组给予同样的操作，但只分离颈总动脉不进行结扎。红景天苷组大鼠于造模后7d给予红景天苷10mg/kg（1.5g溶于1L 0.9%氯化钠溶液，6.7ml/kg）灌胃治疗；对照组和模型组大鼠给予0.9%氯化钠溶液（6.7ml/kg）灌胃，3组均为1次/d，连续4周。实验过程中对照组大鼠无死亡，模型组和红景天苷组各死亡3只，行水迷宫实验时每组大鼠各12只。

1.4 水迷宫实验检测大鼠认知功能 红景天苷治疗4周后行水迷宫实验检测各组大鼠空间学习记忆能力的差异，水迷宫一人电脑操作，一人动物操作，均固定人员不变。水迷宫水池壁高为50cm，水深为40cm，水温维持在20～24°C，水池直径为150cm。在水迷宫的目标象限正中心位置放置一个直径为10cm的水下隐性平台，平台上表面位于水下1cm处。前5d进行定位航行实验，4次/d，每次从不同入水点放入大鼠。每只大鼠面朝水池壁放入池中，记录逃避潜伏期，即大鼠寻找平台的时间。若大鼠120s内未到达水下平台，则将大鼠小心引导至平台上，并让其逗留15s，120s则为该大鼠逃避潜伏期时间。第6天，撤去水下平台，记录每组大鼠目标象限停留时间。水迷宫6d实验方案见表1。

表1 水迷宫实验方案

1.5 大鼠脑组织海马MDA水平和SOD活性检测 水迷宫实验后，采用随机数字表法每组选取5只大鼠，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后取脑组织，分离海马，裂解后匀浆在4°C条件下使用离心机离心10min（12 000×g），留取上清液。采用ELISA法检测大鼠脑组织海马MDA水平和SOD活性。所有操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.6 大鼠脑组织海马TNF-α和IL-6水平检测 水迷宫实验后，采用随机数字表法每组另选取5只大鼠，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后取脑组织，分离海马，裂解后匀浆在4°C条件下使用离心机离心5min（12 000×g），留取上清液。采用ELISA法检测大鼠脑组织海马TNF-α和IL-6水平。所有操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.7 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件。计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠逃避潜伏期与目标象限停留时间比较与对照组相比，模型组和红景天苷组大鼠逃避潜伏期均延长，目标象限停留时间均缩短，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与模型组相比，红景天苷组大鼠逃避潜伏期缩短，目标象限停留时间延长，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表 2。

2.2 各组大鼠海马MDA水平和SOD活性比较 与对照组相比，模型组和红景天苷组大鼠海马MDA水平均升高，SOD活性均降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与模型组相比，红景天苷组大鼠海马MDA水平降低，SOD活性升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表3。

表2 各组大鼠逃避潜伏期与目标象限停留时间比较（s）

表3 各组大鼠海马MDA水平和SOD活性比较

2.3 各组大鼠海马TNF-α、IL-6水平比较 与对照组相比，模型组和红景天苷组大鼠海马TNF-α、IL-6水平均升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与模型组相比，红景天苷组大鼠海马TNF-α、IL-6水平均降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表4。

表4 各组大鼠海马TNF-α、IL-6水平比较（ng/ml）

3 讨论

VD是老年人痴呆的第二常见的病因，患者不仅记忆下降，执行功能也会出现严重受损[10]。高血压、糖尿病、高胆固醇血症和高同型半胱氨酸血症是VD的重要风险因素。目前对于VD的临床治疗仍无特效的治疗方法。红景天苷是红景天的重要成分，具有多种药物活性，如改善缺氧状态、抗肿瘤、抗疲劳和抗毒性等作用[3-7]。

本研究发现，与对照组相比，VD大鼠逃避潜伏期明显延长，目标象限停留时间明显缩短，说明VD大鼠的认知功能与对照组相比明显受损；经红景天苷治疗后，VD大鼠逃避潜伏期明显缩短，目标象限停留时间明显延长，提示红景天苷可明显改善VD大鼠空间认知功能的损害。

氧化应激是与脑卒中相关的神经损伤和认知功能障碍的调节剂，在大鼠脑梗死灶周围出现氧化DNA损伤[11-13]。氧化应激不仅与VD有关，而且与VD的所有危险因素均有关。MDA、SOD在很多研究中被广泛地用来代表氧化应激能力的水平[14-15]。在氧化损伤过程中，MDA水平增加被认为是脂质过氧化作用的一个特殊标志[16]。此外，氧化应激损伤可能会导致抗氧化防御系统的损伤，如SOD活性降低。研究发现VD患者较阿尔茨海默病患者显示出更高水平的MDA[17]。本实验发现VD大鼠海马MDA水平升高、SOD活性降低，说明VD大鼠模型出现氧化应激损伤，这与之前的研究结果一致。红景天苷治疗后MDA水平和SOD活性发生了逆转，证实了红景天苷治疗改善VD大鼠的空间学习记忆功能可能与其抗氧化应激损伤作用密切相关。

近年研究表明，异常的细胞因子网络在卒中后的认知功能损伤中扮演着重要的角色。Zhang等[18]研究发现TNF-α可能会损害大鼠缺氧后突触传递的恢复过程。TNF-α是一种促炎性细胞因子，主要由激活的噬细胞、T淋巴细胞和肥大细胞产生[19]。TNF-α是在激活宿主先天防御时首先产生的促炎性细胞因子，上皮和内皮细胞是其主要靶点[20]。TNF-α对目标细胞产生多重影响，包括刺激这些细胞产生和释放多种炎性细胞因子[21]。有研究报道TNF-α与精神分裂症患者的认知功能同样也存在密切联系[22]。IL-6是一种多功能的细胞因子，与宿主的先天防御和炎症反应密切相关，在多种炎症条件下，IL-6水平均会发生变化[23]。TNF-α、IL-6等促炎性细胞因子被认为与阿尔茨海默病和VD的发病机制息息相关[24]。Sudduth等[25]通过引发大脑神经炎症，升高动物大脑中TNF-α、IL-6水平可成功诱导出高同型半胱氨酸血症相关的VD模型。本实验观察到VD大鼠海马TNF-α、IL-6水平均升高，红景天苷治疗后大鼠海马TNF-α、IL-6水平均降低，提示红景天苷治疗对VD大鼠具有明显的抗炎特性。

综上所述，红景天苷治疗可明显改善VD大鼠认知功能，降低MDA水平，升高SOD活性，抑制了VD大鼠海马促炎性细胞因子TNF-α及IL-6的表达，其对VD大鼠发挥神经保护作用的机制可能与抗炎、抗氧化应激损伤作用密切相关。本实验结果证实了红景天苷治疗对VD大鼠的神经保护作用，这为VD或其他类型痴呆的基础和临床治疗提供一定的理论基础。但本实验发现红景天苷治疗未使VD大鼠的认知功能得到完全改善，也显示了其治疗的一定局限性，在今后的实验中我们将会对其机制进一步深入研究。