细胞释放的微粒的检测方法研究进展

杨荟圆 路 明 张迎媚

微粒(MPs)是各种血液细胞、血管内皮细胞、肿瘤细胞受刺激活化或凋亡而释放到血液循环中的直径0.1～1.0μm的小泡状膜颗粒[1]。当细胞活化或凋亡时，细胞膜脂质双层不对称性丧失，引起一系列的生物学变化，使细胞膜脱落形成MPs[2]。MPs不仅仅是简单的细胞脱落物，它携带有其来源细胞的一些基本物质，主要包括脂类和蛋白质，也包含mRNA、microRNA，但没有细胞核结构。各种细胞来源的MPs表面均携带有其母体细胞的特异表面抗原。MPs表面还有磷脂酰丝氨酸(PS)暴露，这一点与细胞不同。

MPs具有广泛的生物学活性，其生物学特性在很大程度上取决于其蛋白质和脂质组成，而蛋白质组成又取决于其来源的细胞和导致其产生的刺激因素[3]。例如，来自内皮细胞的MPs (EMPs) 含有大量的代谢酶、参与细胞外渗的蛋白质和细胞骨架相关的蛋白质；血小板释放的MPs (PMPs) 表面则富集整合素、p-选择素等蛋白，而活化中性粒细胞来源的MPs中整合素Mac-1浓度较高[4]。MPs也可以作为细胞与细胞之间传递信号的媒介。MPs在炎症、免疫、与癌症相关的静脉血栓栓塞 (VTE) 和血管等疾病的发生、发展中发挥着重要作用，对于这些疾病，检测 MPs性质及水平有助于监测病情、指导治疗及判断疗效[5，6]。但是，由于MPs 极小，常规检测方法的敏感度和分辨率常常不够，使得 MPs 的检测受到很大限制。

本文介绍了许多检测MPs的方法，用来确定的MPs直径、数量、形态学、细胞来源和生物学活性。这些分析MPs的方法各有其优势和不足，微粒检测方法的标准化在技术方面还面临极大挑战。本文从定性和定量分析两方面对MPs一些常用的检测方法做一简单介绍。

一、 定性分析方法

1.透射电子显微镜法(TEM)：TEM利用电子获得样本的二维图像，它的特点是具有极高的分辨率(接近0.1nm)，可以用来评估MPs的直径、膜的形态和组成[7]。使用胶体金标记的抗体可以获得关于MPs抗原成分的信息[8]。

该方法需要通过超离心技术使样品中的MPs浓缩，因此不能对原样本中MPs的数量进行定量分析[9]；不能直接检测血浆中的MPs，因为它需要对样品进行固定和脱水，而这一操作过程对MPs的直径和形态有着直接的影响[10]。该方法样本制备过程非常耗时，而且镜下检测也需要几个小时。因此本方法主要用于对MPs的直接观察或对其他检测进行验证。

2.激光扫描共聚焦显微镜技术(LSCM)：LSCM是荧光显微镜的一个现代变异体，在激光扫描共聚焦显微镜中，使用激光做光源，与荧光显微镜比较，提高了图像的分辨率；计算机代替了人眼或者照相机进行观察、摄像，得到的图像是数字化的，提高了图像的清晰度；光电倍增管的应用，提高了检测的敏感度。LSCM检测前，先超速离心分离得到MPs，用PS的特异结合蛋白Annexin V固定MPs以阻止其布朗运动，然后用荧光素偶联的抗体对MPs表面特异抗原进行标记[11]。此方法检测结果取决于针对目标抗原的抗体的特异性和亲和力，以及MPs表面抗原的密度。LSCM技术还能够获得MPs的直径、形态和结构信息[12]。该方法的不足是耗时长(每个样品需要分析几个小时)，而且不能对血浆中的MPs直接进行检测。

3.原子力显微镜检测(AFM)：AFM是一种可以用来研究固体材料表面结构的分析仪器。它通过检测待测样品表面和一个微力敏感元件之间的极微弱的原子间相互作用力来研究待测样本的表面结构及性质。将一对对微力极端敏感的微悬臂一端固定，另一端的微小针尖接近样品，这时针尖将与样品表面相互作用，作用力将使得微悬臂发生形变或运动状态发生变化。扫描样品时，利用传感器检测这些变化，就可以获得作用力分布信息，从而以纳米级分辨率获得待测样品表面形貌结构信息及表面粗糙度信息。AFM可以检测单个MP，形成检测样品的三维图像[13]。

该方法要求测量前将MPs从血浆或其他样品中分离出来、浓缩，并使之紧密结合固定到载体平面上，这会影响MPs的形态和数量，也无法测得MP的直径。云母是一种绝缘矿物，涂于载体平面表面，特异抗体再涂于云母表面，与MPs样本孵育后，携带相应抗原的MPs即可紧密结合到载体平面上。该方法的优点是能提供真正的检测样品的三维表面图；可以直接在液体环境中检测MPs，使MPs维持在生理状态。尽管AFM允许检测MPs并确定其表型，但不能获得关于MPs功能特性的信息；成像范围太小；耗时费力(检测一个样本约需2h)。

二、定量分析方法

1.光学显微镜技术：光学显微镜的最高分辨率为200nm，比普通显微镜高50倍，可以看到检测样品的亚显微结构，特别适合用来观察微小的颗粒。光学显微镜结合图像分析软件可以对MPs进行定量分析，但很费时(分析10000 个MPs需要几个小时)，并且这种方法不能提供关于MPs的细胞起源、抗原成分等方面的信息。

2.荧光显微镜技术：是将荧光与显微镜技术相结合的一种检测技术，也是一种很有前途的MPs检测技术。其利用荧光素标记的抗体检测微粒表面特异的抗原，从而对微粒的特定属性进行定量分析。这种方法同样耗时较长(每个样本平均检测时间约为1h)，并且不能测量MPs的直径。随着光学成像技术的不断进步，荧光显微镜是一种很有前景的MPs检测技术，例如借助FITC-annexin V标记PS，荧光显微镜可以动态观察MPs自细胞膜脱落、形成的过程[14]。但是，由于纳米级MPs的快速布朗运动的存在，限制了该技术敏感度的提高[11]。

3.流式细胞术：流式细胞术是最常用的鉴定MPs、并对其进行定量分析的方法[15]。该方法检测MP获得两部分参数：散射光强度和荧光强度(荧光偶联于抗体上并进一步结合到特异的目标抗原上)。前向角散射光(FSC)强度反映细胞/MPs的直径，而侧向角散射光(SSC)强度提供待测细胞/MPs内颗粒结构复杂程度的信息[11]。使用已知大小的荧光素标记的标准微球，通过比较MPs与标准微球的FSC强度，可以确定MPs群[16]。使用已知浓度的荧光素标记的标准微球，将其添加到特定体积的MPs样品中，通过计算检测到的MPs与标准微球的数量比，可以确定样品中MPs的浓度[17]。用针对细胞特异抗原的荧光标记的抗体对MPs进行染色，可以评估MPs的细胞来源。此外，使用荧光素标记的Annexin V，可以验证MPs的磷脂分布特性，即MPs表面有PS的暴露[18]。

流式细胞术的一个主要优点是可以采用荧光素双标甚至多标法测定MPs的起源。流式细胞术的另一个优势是每秒可以分析成千上万个MPs[19]。流式细胞术不需要检测前从待测样本中分离MPs，因此能很好地保留MPs的形态学特征，并防止MPs数量的丢失。然而，流式细胞术也有一些局限性：它没有提供细胞形态学方面的详细信息；受仪器分辨率的限制，绝大多数流式细胞仪不能检测0.1～0.4μm直径的MPs；小的MPs聚集成团，会被记为一个MPs；实验重复性差；检测结果受仪器的类型、设置、数据分析者的能力以及样品的制备和储存方法等影响较大[20]；虽然使用表面抗原特异抗体可以检测MPs起源，但当MPs表面抗原的量少，同时伴有抗原抗体的结合能力相对弱时，特异性荧光强度较低，MPs可能不能被检出。

4.基于阻抗的流式细胞术：该技术的工作原理也是目前普遍使用的血细胞分析仪的工作原理，又称库尔特原理。无论是血细胞还是MPs，都是电的不良导体。将待测样本用电解液稀释，悬浮于电解质溶液中的颗粒被抽吸而通过两侧置有两枚电极的小孔的周边。当控制通过该小孔电流时，小孔周边会产生一个电感应区，随着每个颗粒通过该电感应区，颗粒会置换出电感应区内等体积的导电液体，瞬间增加了该电感应区的电阻。这种电阻的变化经过一个放大器会产生一种成比例的电脉冲，仪器能够对电脉冲进行精确的测量。这种脉冲的强度与产生它的颗粒的大小呈正比，因此就可以在几秒钟内对液体中的颗粒进行识别和计数。该技术的检出下限为300nm，因此直径<300nm的MPs不能检出。该方法不能提供MPs的形态、细胞来源、功能等方面信息。

5.免疫印迹法(Western blot法)：MPs用裂解液裂解后，用聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离蛋白质，然后将凝胶上的蛋白质转移到固相载体硝基纤维素膜或聚偏氟乙烯膜上，用针对特定抗原的一抗标记，再用针对一抗的带有标志物的二抗孵育，最后标志物显色，结合特定图像分析软件，即可定量MPs中特定抗原的表达量[21，22]。

Western blot法分析需要大量MPs，这限制了该方法应用于血浆MPs的检测；另外，该法允许研究MPs的蛋白表达，但不能提供关于MPs直径和数量的信息。

6.酶联免疫吸附试验(ELISA)：ELISA是利用抗原抗体特异结合特性对样本中特异蛋白进行定量分析的一种简便易行的检测方法。该方法重复性好，可用来定量分析MPs表面的抗原，也可以通过定量MPs表面携带的PS的量间接地定量MPs的数量[23]。包被于96孔板上的Annexin V或针对MPs表面特异抗原的抗体(捕获抗体)，与血浆中MPs特异性结合后，用针对MPs表面特异抗原、与荧光素偶联的抗体(检测抗体)检测被捕获MPs的表面抗原的表达量；用与荧光素偶联的Annexin V代替检测抗体，可以检测出MPs表面PS的总量，从而间接测定MPs的数量。

ELISA检测MPs的优点为可以同时检测很多样本，是一种高通量检测方法；没有MPs直径限制；能定量评估MPs数量。该方法也有一些缺点：仅能检测可溶性抗原；不能提供MPs直径的信息；存在Annexin V非特异性结合，使该方法的应用受到限制[24]。另外，该方法需要使用新鲜的血浆，因为冻融会引起MPs表面PS的数量增加。

7.用于定量MPs表面特定生物活性分子的功能实验：本法是基于MPs的某些特定生物学功能对MPs特定性征进行定量分析。例如，PS具有促凝血活性，而MPs表面暴露有PS，因此，采用MPs促凝活性/促凝血酶生成活性检测实验，就可以间接测定MPs数量[2,25]。再如，MP-TF活性检测实验通过测定MP-TF依赖的凝血因子Xa的生成量，可以确定MPs表面携带的活性TF的量[26，27]。由于MPs表面携带的、有特定生物学活性、适合分析的分子种类很少，此类检测方法数量十分有限。

功能实验的优点是操作简单，可以同时分析很多样本，检测的是样本中全部MPs的功能，不受MPs直径和来源的限制。该方法的不足是它们不能评估样本中MPs的直径及数量。

到目前为止，流式细胞术与功能实验在MPs检测方面获得的数据不多，但两种方法测定的结果一致性差。考虑到流式细胞术不能检测直径<400nm的MPs，而血浆中直径<200nm的MPs在凝血过程中的作用不可忽视，那么从功能实验和流式细胞术中得到的结果不一致是可以理解的。

三、MPs检测方法的选择

从上述介绍可以看出，每种检测方法有其各自独特的用途、优势和不足，充分了解每种检测技术是选择适合的检测方法的前提。针对不同的研究目的，结合不同的实验室实际条件，可以选择不同的检测方法，来获得研究者所需要的信息。比如，很多实验常常需要同时获得关于MPs数量与来源方面的信息。经上面分析可知，流式细胞术、ELISA都是可以选择的能同时获得这两方面信息的方法。例如Sarlon-Bartoli等[16]在分析白细胞来源MPs的血浆水平与颈动脉高度狭窄患者的不稳定斑块的相关性的研究中用高敏感度流式细胞仪测定血浆中不同MPs的细胞来源及数量。有研究者使用ELISA法对脑梗死慢性期患者血浆中的血小板来源MPs的水平进行了定量分析。还有一种技术，该技术的原理是将ELISA与定量MPs表面PS的功能实验两种检测方法结合起来，也能达到同时获得这两方面信息的目的。Delabranche等即使用了这一技术对血浆中不同细胞来源的MPs在感染性休克引发的DIC中的数量变化情况进行了动态监测。另外，还可以将定性与定量分析方法联合应用，利用每种分析方法的优势，来弥补另一分析方法的不足。比如研究者采用透射电镜和流式细胞术技术对急性呼吸窘迫综合征大鼠血浆中不同细胞来源的微粒进行了定性、定量分析。再如Hughes等将正常人血小板置于肝素诱发的血小板减少症患者血浆中，并加入肝素激活血小板，然后联合使用电子显微镜、共聚焦显微镜和流式细胞术等技术，对血小板释放微粒情况进行定性、定量分析。

四、展 望

人血浆中循环MPs的发现具有重大意义，深入研究MPs的机制，可为临床许多疾病包括心血管疾病、凝血相关疾病以及一些恶性疾病的诊断、病情评估、疗效判定提供依据。近年来，关于MPs的分析方法多种多样，但都存在一定的局限性，由于缺乏标准化的检测方法，MPs研究需要进一步发展，用重复性好的方法测量MPs仍然是一个挑战。目前流式细胞术似乎是研究MPs的最佳技术，因为它具有多参数分析的可能性，它不仅提供定量信息，而且提供定性信息，尽管有许多限制，它仍然是检测和分析MVs最常用的技术。随着技术的进步，硬件设施分辨率的逐渐提高，方法学的进一步完善和发展，MPs的检测方法将会越来越标准化，这将会有效促进MPs在生理和病理情况下发挥作用的研究，也会进一步促进MPs在临床疾病的诊断和治疗中的应用。