呼吸道感染婴幼儿血清模式识别受体RIG-I和MDA-5表达的意义

蒋珍凤 王恩智 童夏生

天然免疫是机体的第一道防御系统，在感染性和非感染性疾病中都起着重要作用[1-2]。病毒或微生物感染后，机体的天然免疫反应会被激活，病原体相关分子模式通过不同的模式识别受体识别和清除病原微生物。模式识别受体包括Toll样受体、核苷酸结合寡聚化结构域受体和维甲酸诱导基因-I（RIG-I）样受体等家族[3]。婴幼儿期呼吸道感染最常见的疾病之一，大多由病毒感染引起，主要为呼吸道合胞病毒（RSV）和流感病毒。研究发现，模式识别受体与呼吸道病毒感染有关，但RIG-I样受体家族RIG-I和黑素瘤分化关联基因5（MDA-5），与婴幼儿呼吸道病毒感染的相关性研究较少[4]。本研究通过观察RSV感染的毛细支气管炎和流感病毒感染的急性上呼吸道感染患儿血清RIG-I和MDA-5浓度的变化，探讨模式识别受体在呼吸道感染的不同部位及不同种类病毒感染中的作用，为婴幼儿呼吸道病毒感染的发病机制和可能的靶向治疗提供理论依据。

1 临床资料

1.1 一般资料 选取2016年11月—2017年4月台州市中西医结合医院的住院患儿90例，均符合毛细支气管炎或急性上呼吸道感染的诊断标准[5]。本研究取得患者家属知情同意，经医院医学伦理学委员会审核通过。

1.2 纳入及排除标准 纳入标准：符合毛细支气管炎或急性上呼吸道感染的诊断标准；毛细支气管炎组血清RSV均呈阳性表达，急性上呼吸道感染组流感病毒均呈阳性表达（采用间接免疫荧光法检测，试剂盒购自西班牙VIRCELL，S.L公司）；病程24～48h；毛细支气管炎组住院时间为12～14d。排除标准:合并有严重心、肝、肾等重大脏器疾病；甲状腺疾病等免疫性疾病史；恶性肿瘤；2周内有感染病史；最近2周内使用过糖皮质激素。

2 方法

2.1 标本采集 采集患儿静脉血各2mL，急性上呼吸道感染组和对照组在就诊时采集，毛细支气管炎组分别于患儿就诊时（急性期）和治疗后（恢复期）采集，标本静置2h后分离血清（3000r/min离心15min），置于-80℃冰箱贮存，集中检测。

2.2 血清RIG-I和MDA-5蛋白检测 采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法，检测血清RIG-I和MDA-5的蛋白浓度。操作方法：试剂盒和96孔反应板置于室温，先后在反应孔里加入标品40μL、RIG-I和MDA-5抗体各10μL、混匀、置37℃温育30min、洗涤、酶标试剂50μL、显色剂 A 50μL、显色剂B 50μL、37℃避光显色 15min、加终止液 50μL，全自动酶标仪450nm波长测量各孔的吸光度（OD值），绘制标准曲线，根据各标本吸光度值在标准曲线上查得相应的浓度。RIG-I和MDA-5试剂盒均购自Bio-Gram 公司（生产批号 SU-B11924、SU-B10697），酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清RIG-I和MDA-5蛋白表达浓度（灵敏度：最低检测浓度＜0.1ng/mL）。

2.3 统计学方法 应用SPSS16.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，三组间均数比较采用单因素方差分析，方差齐性者采用LSD法，方差不齐者采用Tamhame’s T2检验，同组比较采用配对资料的t检验，两变量的相关性采用Pearson相关分析法，P＜0.05为差异有统计学意义（双侧检验）。

3 结果

3.1 三组研究对象一般资料比较 毛细支气管炎（毛细支气管炎组）46例，男22例，女24例；年龄0.5～3岁，平均（1.62±0.84）岁；急性上呼吸道感染（急性上呼吸道感染组）44例，男18例，女26例，年龄0.3～3岁，平均（1.54±0.88）岁。对照组 44例来自同期在温岭市卫生进修学校儿科门诊健康体检儿童，男23例，女 21例，年龄 0.3～3岁，平均（1.47±0.77）岁。三组患儿性别、年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

3.2 三组研究对象血清RIG-I和MDA-5表达水平比较 毛细支气管炎组急性期和急性上呼吸道感染组血清RIG-I和MDA-5蛋白浓度均显著高于对照组（P均＜0.01）；毛细支气管炎组急性期血清RIG-I蛋白浓度显著高于急性上呼吸道感染组（P＜0.05），两组间MDA-5蛋白浓度差异无统计学意义（P＞0.05）。毛细支气管炎组恢复期血清RIG-I和MDA-5蛋白浓度均显著低于急性期（P均＜0.01）。见表1。

表1 三组呼吸道感染婴幼儿血清RIG-I和MDA-5蛋白浓度比较（ng/mL，±s）

表1 三组呼吸道感染婴幼儿血清RIG-I和MDA-5蛋白浓度比较（ng/mL，±s）

注：与对照组比较，*P＜0.01；与急性上呼吸道感染组比较，△P＜0.05；与同组急性期比较，▲P＜0.01；RIG-I：维甲酸诱导基因-I；MDA-5：黑素瘤分化关联基因5

组别对照组急性上呼吸道感染组毛细支气管炎组急性期恢复期F值P RIG-I 5.43±1.77 12.37±4.16*MDA-5 7.42±2.07 15.50±4.29*14.60±4.05△*9.94±4.14▲82.63＜0.01 18.19±6.95*12.98±5.54▲58.30＜0.01

3.3 相关性分析 RIG-I和MDA-5表达呈显著直线正相关（r=0.52，n=134，P＜0.01）。

4 讨论

细胞内的模式识别受体由RIG-I样受体蛋白家族组成，主要成员为RIG-I和MDA-5，两者在形态学上具有高度同源性，包括2个N-末端半胱氨酸蛋白酶募集反应结构域和解螺旋酶结构域和C-未端抑制结构域，并通过共同的细胞内信号传导系统触发机体的天然免疫反应[6]。在细胞质中，RIG-I具有5′端成族的三磷酸盐的结构，而MDA-5活性结构是具有较长的双链RNA，在外源性的RNA诱导下发生一连串的级联反应，包括干扰素β和核转录因子κB，产生I型干扰素和促进天然免疫反应[6]。通常，RIG-I样受体蛋白家族分享检测病毒感染的分子信号结构，目前已证实家族成员间在抗病毒的过程中具有协同作用[7]。RIG-I信号由自身细小的核糖核酸酶分解产物所激活，识别相对较短的双链RNA（小于1kb），MDA5 识别长的双链 RNA（大于 2kb）。由于RIG-I和MDA-5是属于细胞质的解螺旋酶类，具有认识特殊的非自身的抗病毒RNA标记物，能通过线粒体衔接蛋白信号通路促发抗病毒的免疫反应，起到抗病毒作用，达到控制和清除病原体，减轻炎症反应、预防免疫介导的组织损伤的作用[8]。

本研究发现，血清RIG-I蛋白的浓度在毛细支气管炎组急性期高于急性上呼吸道感染组且高于对照组（P＜0.01），提示模式识别受体RIG-I在病毒感染后提升，不同的感染部位或不同病毒其表达水平也不一样，支持RIG-I通过提升其表达水平起到清除病原体的作用。在毛细支气管炎组，随着病情的恢复RIG-I水平也随之下降，提示在疾病的不同阶段RIG-I的表达也不同，表明它与病情相关。相似的结果也见于其他的研究，在流感A型病毒感染后，肺组织RIG-1 mRNA的表达水平下降，认为肺组织损伤、凋亡和水通道的改变与RIG-信号通路有关[9]。在RSV感染小鼠后，肺组织RIG-I和MDA-5蛋白表达水平也增加，与肺组织蛋白酶类表达增加相关[10]。病毒感染的鼻炎患者鼻部上皮细胞的Toll样受体、RIG-I和MDA-5的表达增强，共同参与识别和清除由于病毒入侵引起的炎症反应，其表达水平与病毒诱导的鼻黏膜炎症加重有关，其机制可能是促进鼻黏膜分泌增加IFN-β[11]。

本研究同时发现，毛细支气管炎组急性期和急性上呼吸道感染组血清MDA-5蛋白的浓度均高于对照组（P＜0.01），提示MDA-5也随病毒感染后提升，支持MDA-5能通过提升其表达水平起到清除病原体的作用。在毛细支气管炎组急性期和急性上呼吸道感染组MDA-5蛋白的浓度无差别，提示MDA-5对RSV和流感病毒的感染反应没有特异性。在毛细支气管炎组恢复期，MDA-5蛋白的浓度低于急性期，支持MDA-5水平与病情相关，随着病情的恢复也随着下降。MDA-5表达水平变化也见于其他的报道。在小鼠鼻内接种流感病毒A型后3天，病毒感染的症状加重，鼻黏膜RIG-I和MDA-5的mRNA和蛋白浓度显著增加[12]。通过相关分析，RIG-I和MDA-5表达呈显著直线正相关（P＜0.01），提示模式识别受体之间具有协同作用，共同参与病毒感染的炎症机制。

综上所述，在呼吸道感染婴幼儿血清模式识别受体RIG-I和MDA-5表达增加，可能共同参与清除病毒感染，其表达水平随着病情恢复而相应下降。[本研究受浙江省温岭市科技局基金资助项目（No.2015-1-58）支持。第一作者蒋珍凤现单位为温岭市中医院儿科。]