鼓槌石斛组织培养研究进展

沈丽娟，甘春雁，韦妙琴，杨 蕾

(南宁青秀山风景名胜旅游开发有限责任公司，广西 南宁 530029)

1 引言

鼓槌石斛(Dendrobiunchrysotoxum)，又名金弓石斛，属兰科石斛属多年生附生草本植物。原产于我国云南的西南部，马来西亚、印度东北部、缅甸、泰国、老挝、越南、柬埔寨等地，常常附生于林中的大树上或疏林下的岩石上[1]。鼓槌石斛花姿优雅、玲珑可爱、花色美丽、气味芳香，具有极高的观赏价值，常作为切花或盆花栽植。除此之外，鼓槌石斛还是常用药用石斛种类之一。鼓槌石斛中含有毛兰素、鼓槌菲、生物碱、多糖等抗肿瘤活性成分，其中多糖是多种石斛中所含有的最主要的药用成分[2]，应用前景非常广阔。近年来人们对鼓槌石斛野生资源的过度开采以及由于森林生态环境日益恶化等原因，野生鼓槌石斛资源已濒临枯竭。于是，开始人为繁殖鼓槌石斛，但传统的分株繁殖方式繁殖周期长，且自然繁殖率低，仍不能满足市场需求。因此，利用组培快繁技术培育大量种苗，是规模化生产鼓槌石斛的最佳途径。

目前，针对鼓槌石斛的研究多集中在化学成分、药理作用与活性机理等方面[3]，对组织培养快繁技术方面虽有成功报道，但仍然处于初步阶段。笔者主要从外植体的选择、培养基、生长调节剂、组培苗栽培等方面概述近几年国内鼓槌石斛组织培养的研究进展，分析鼓槌石斛组织培养过程中存在的问题，并提出相关建议与展望，为今后鼓槌石斛的快繁研究提供一定的参考依据。

2 组织培养研究进展

2.1 外植体的选择

目前关于鼓槌石斛组织培养外植体的选择以研究鼓槌石斛的种子为主，利用鼓槌石斛茎段、叶片等作为外植体的研究尚未见有成功报道。究其原因在于种子与其他外植体相比，虽然其后代容易发生变异，不利于亲本性状的保持，且愈伤组织的芽分化频率较低[4]，但操作简单，材料易于获取，量大，不易受到季节和植株发育时期等因素限制；另外种子从无菌播种到获得无菌苗简化了诱导原球茎的步骤，相比用其他器官作为外植体而言，缩短了繁殖培养周期。徐红等[5]、蓝玉甜等[6]、高燕等[7]、康莹莹[8]、付开聪等[9]、刘扬等[10]、崔波等[11]均以鼓槌石斛成熟种子作为外植体进行无菌播种，研究鼓槌石斛的组织培养快繁技术，且获得了大量的种苗。陈文等[12]以未成熟的鼓槌石斛种胚进行离体培养，也成功获得了鼓槌石斛幼苗。

2.2 培养基的选择

培养基贯穿于整个组织培养体系，因此，组织培养成功与否的关键很大程度上取决于对培养基配方的选择。蓝玉甜等[6]通过无菌播种萌发发育成苗及小苗快繁技术试验研究，筛选出了最佳培养基：①鼓槌石斛种子萌发培养基：MS+ 1 mg/L 6-BA +10%香蕉汁+20 g/L蔗糖+6 g/L琼脂+1 g/L AC，种子萌发率达 90% 以上；②原球茎分化培养基：N6 + 2.0 mg/L NAA + 0.5 mg/L BA + 20 g/L蔗糖+ 10%香蕉汁+ 0.5 g/牛肉蛋白胨+ 5.8 g/L琼脂+ 0.5 g / L AC， 培养出的苗整齐度高，均匀；③生根壮苗培养基：N6 + 1.5 mg/L NAA + 10%香蕉汁+ 20 g /L蔗糖+ 5.8 g/L琼脂+ 1 g/LAC，苗生根数多、粗壮、整齐，叶浓绿。高燕等[7]以鼓槌石斛野生种质资源人工杂交获得的蒴果种子为外植体，进行组培快繁研究表明，①种子萌发最佳培养基为 1/2Mb + 1g/L水解乳蛋+2.5%白糖，萌发率达 95%；②增殖分化培养基为3/4 Mb+ 0.2 mg/L NAA +6-BA 0.1 mg/L+8%马铃薯泥+4%香蕉泥+3%白糖，增殖倍数达12.6倍；③壮苗生根培养基为3/5 Mb+0.5 mg/L NAA + 0.1 mg/L IBA + 5%马铃薯泥+7%香蕉泥+0.1% AC +2%白糖，生根率达100%。康莹莹等[8]对鼓槌石斛进行离体快发研究发现种子萌发最佳培养基为1/4 MS+ 0.5 mg/L KT +1.0g/L蛋白胨+150.0 g/L椰乳+15.0 g/L糖+1.0 g/L AC(pH=6.0)，种子萌发率达100%。刘扬等[10]对鼓槌石斛种子无菌萌发培养、原球茎继代增殖、生根壮苗培养基的筛选研究，结果表明：①较理想的种子萌发培养基为1/2 MS+1.0 mg/L NAA+8.0%土豆泥+0.1%活性炭，种子萌发率较高，发芽快；②最适增殖培养基为3/4 MS+ 3.0 mg/L 6-BA+8%香蕉泥，增殖系数可达7.23；③最佳生根培养基为3/4 MS+1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L CA+8%香蕉泥，根平均数量达7.49条。崔波等[11]对鼓槌石斛无菌苗增殖培养条件进行了研究，结果表明：①最佳无菌苗增殖培养基为MS+ 0.5 mg/L NAA +2.0 mg/L BA +50 g/L香蕉泥，增殖系数高达4.7，长势良好、芽苗健壮；②壮苗生根培养基为1/2MS+0.3 mg/L NAA，生根苗根系长而粗壮，叶色浓绿。陈文等[12]在鼓槌石斛组培生根壮苗培养过程中试验了5种基本培养基，发现培养效果最好的是H基本培养基，鼓槌石斛组培苗的根系最发达，根粗壮且植株健壮。

2.3 生长调节剂

不同生长调节剂种类及浓度对鼓槌石斛的组织培养有着很大的影响。徐红等[5]研究发现在最适宜鼓槌石斛组织培养幼苗生长的N6培养基的基础上，附加0.5 mg/L NAA与1.0 mg/L 6-BA有利于幼苗的生长与分化。蓝玉甜等[6]研究不同激素及浓度对鼓槌石斛生根壮苗培养的影响，结果表明1.5 mg/L NAA的浓度对鼓槌石斛生根及小苗生长情况最佳。高燕等[7]在基本培养基中添加1 g/L水解乳蛋白，利于种子萌发；原球茎增殖分化培养基中添加0.2 mg/LNAA，利于小苗的生长，且增值分化效果好；0.5 mg/L NAA与0.1 mg/L IBA的组合对壮苗生根有促进作用；在生根壮苗培养基添加0.1%AC可降低培养基褐化，减少黄叶。康莹莹等[8]研究发现香蕉泥对鼓槌石斛增殖效果最好；以株高大于3 cm的试管苗为材料进行生根研究，发现选用0.3 mg/L NAA壮苗生根效果最好。付开聪等[9]运用鼓槌石斛的成熟种子寻找鼓槌石斛快繁育苗的有效途径，结果表明：当6-BA、NAA的浓度不超过2.0 mg/L时，可促进鼓槌石斛的胚发育和成苗，浓度为1.5 mg/L时，可使发芽、生根和壮苗效果达到最佳；鼓槌石斛形成小苗时N、P、K最佳的比例为2∶1∶3。刘扬等[10]进行鼓槌石斛最佳增殖培养基的研究，结果表明：在培养基中添加3.0 mg/L KT 与3.0 mg/L 6-BA 虽然都显著提高了原球茎的增值率，但从生长表现来看，添加KT后，增殖出来的小苗容易畸形，叶片出现卷缩现象，添加3.0 mg/L 6-BA的培养基较适宜于鼓槌石斛增殖培养，增殖倍数约达7左右。陈文等[12]在利用鼓槌石斛未成熟种胚进行离体培养研究时发现，BA 会抑制幼苗根的形成，适当降低培养基中无机盐的浓度利于幼苗根系的形成。

2.4 组培苗移栽

高燕等[7]对鼓槌石斛组培苗移栽季节及基质的研究发现鼓槌石斛组培苗在3～4月移栽最佳，可使假植培育时间缩短1个月以上；栽培基质以树皮屑和杂木刨花比例为2∶1的组合最好，移栽成活率达96%。康莹莹等[8]将鼓槌石斛组培苗移栽到苔藓基质中，成活率达到80%。刘扬等[10]将鼓槌石斛组培苗移栽到栽培基质为松树皮的苗床上，移栽1个月后的成活率达 80%。李蕾等[13]以鼓槌石斛组培苗为材料进行移栽试验，结果表明使用树皮、水苔、锯末在春秋两季的成活率均达到95%以上。付开聪等[9]将鼓槌石斛组培幼苗移栽到由1/3碎椰糠和2/3粗油棕叶鞘纤维组成的栽培基质上，存活率达98.6%。

3 存在的问题

目前国内对鼓槌石斛组织培养快繁技术的研究仍然较少，且仍停留在初步研究阶段。虽然鼓槌石斛的组培快繁育苗已取得了成功，但是对鼓槌石斛规模化快繁技术系统的研究尚未见相关报道，而且在组织培养过程中存在一些问题仍需进一步探讨、研究和完善：①目前对鼓槌石斛的组培研究过程大多数选择成熟蒴果的种子作为外植体，而尚未见以叶片、茎段、幼芽、花梗、根尖等作为外植体进行研究的相关成功报道。崔波等[11]曾尝试用鼓槌石斛组培苗的茎段和叶片进行组培试验，康莹莹等[8]尝试以叶片进行组织培养，但均未获得成功，原因是否与培养材料种类、取材大小、培养基配方等有关，仍需要进一步进行试验研究。②培养基的褐变会导致幼苗生长高低不一，高度参差不齐。蓝玉甜等[6]的研究表示添加1 mg/L活性炭后的培养基不会出现褐变现象，且小苗生长均匀，整齐度好；高燕等[7]也表示在生根壮苗培养基中添加0.1%活性炭可降低培养基褐化，但在刘扬等[10]的研究中发现，活性炭的最佳浓度为0.05%，大于0.1% 时会出现抑制效应。因此，对不同阶段添加不同的添加物以及添加物浓度的多少对鼓槌石斛组培研究的影响仍需进一步研究探讨。③目前对鼓槌石斛的离体培养研究，虽然可通过大量种子无菌播种直接萌发为无菌小苗，缩短了培养周期，但仍缺乏深入、系统的研究，还未形成一套较为成熟的鼓槌石斛规模化生产应用组培快速繁育技术。

4 展望

鼓槌石斛的药用价值及观赏价值均较高，随着鼓槌石斛被广泛应用，市场上已出现种苗供不应求的情况。因此，通过对鼓槌石斛进行组培快繁技术的研究，对种质资源收集保育、规模化生产栽培、缓解市场药用石斛紧缺局面具有非常重要的意义。同时对鼓槌石斛种植资源的引进、优化，组织培养各个阶段的优化研究，以及多种外植体选择、培养基的筛选、生长调节剂、其他添加物、培养条件及炼苗栽培等方面的摸索仍是今后的重点研究方向，以期为建立健全、高效、标准化的鼓槌石斛组培快繁技术体系提供理论依据，实现鼓槌石斛的规模化生产，从而满足市场需求。