6种药用植物的2个组织的内生细菌多样性初步分析

宋庭宁，洪宗国，曹 夕，朱薪颖，麻晓宇，袁 琳

(中南民族大学 药学院，湖北 武汉 430074)

1 引言

植物内生菌(Endophyte)是部分阶段或所有阶段生活于健康植物的组织和器官内部的细菌、真菌或放线菌[1]。植物内生细菌是植物微生态系统的不可缺少的组成部分，它们长期生活在宿主植物体内，与宿主植物相互提供所需要的营养，并通过自身新陈代谢或某些信号传导的方式对植物生长产生作用，有利于加强植物对环境的适应能力[2]。目前已证实植物内生菌的作用主要有促生作用、产生活性成分(如抗肿瘤物质、抗菌活性成分、抗病毒物质)、抗病虫害作用、外源基因载体、降解环境污染物等[3]。由于植物内生菌能产生多种活性成分，在生物防治，医药卫生等领域的应用潜力非常大，现已成为国内外学者研究的热点[4]。植物内生菌群落结构丰富，有较多的内生菌资源没有被发现，因此对植物内生菌的研究具有良好的发展前景。 白英(SolanumlyratumThunb.)为茄科茄属的植物，用于治疗疟疾、黄疽、水肿、淋病、风湿关节炎、胆囊炎、癌症等[5]。巴天酸模(RumexpatientiaLinn.)为蓼科酸模属植物，可凉血止血，清热解毒，通便杀虫[6]。葎草(Humulusscandens(Lour.) Merr.)是桑科，属多年生攀援草本植物，具有清热解毒，利尿通淋的作用[7]。泽漆(EuphorbiahelioscopiaL.)为大戟科草本植物，其地上部份具有利尿消肿，化痰散结，杀虫止痒的功效[8]。商陆(PhytolaccaacinosaRoxb)为商陆科商陆属多年生粗壮草本植物，根入药，以白色肥大者为佳，红根有剧毒，仅供外用，用于通二便，逐水、散结，治水肿、胀满、脚气、喉痹，外敷治痈肿疮毒[9]。野老鹳草(GeraniumcarolinianumL.)为牻牛儿苗科老鹳草属的植物，具有祛风活血、清热解毒等功能[10]。这6种植物分别采集于湖北省武汉市东湖马鞍山森林公园、华中农业大学狮子山、中南民族大学南湖边。属于亚热带季风气候，并且3个地点都具有较为丰富的药用植物资源，但不同的是马鞍山森林公园植被较其他两个地方浓密，并且植物生长环境较好，有森林和湿地两大特色。华中农业大学与中南民族大学都依南湖而建，气候相似，但华中农业大学所采植物较中南民族大学而言环境较干净，中南民族大学所采植物为南湖附近，属于污染较为严重的地方。植物内生菌受宿主植物、环境及季节等多因素的影响[11]。本文主要选取武汉市内3个不同地方常见6种药用植物，对不同植物、不同器官、不同采集地点的内生菌多样性进行初步探讨，对于寻找优良内生菌功能菌株有重要的指导意义，从而给新药的研发提供了思路和参考。

2 实验材料

2.1 植物样本采集

6种植物样本分别采集于马鞍山森林公园、中南民族大学、华中农业大学狮子山，每个地方随机采取2～3株健康生长的完整植株，装入无菌自封袋，放入冰盒，尽快带回实验室 4 ℃保存，次日用于总DNA提取。

2.2 实验仪器

高速冷冻离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司生产)、分析天平(奥豪斯仪器有限公司生产)、NanoDrop One微量分光光度计(Thermo Scientific公司生产)、PD-FBI X线胶片观察灯(广东粤华医疗器械厂有限公司生产)、PTC-100PCR扩增仪(美国MJ Research公司生产)、DYY-4C高压双稳电泳仪(北京六一生物科技有限公司生产)、DYCP-31D水平电泳槽(北京六一生物科技有限公司生产)、凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司生产)、梯度凝胶电泳仪及TD331-AP1 型梯度胶电动生成器(北京君意东方电泳设备有限公司生产)。

2.3 实验试剂及配置

CTAB提取液(2%CTAB，1mol/L Tris-Hcl pH8.0，1.4 mol/L NaCl，0.5 mol/L EDTA pH8.0，2%巯基乙醇)、高浓度CTAB溶液(10%CTAB， 0.7 mol/L NaCl)、苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)、氯仿∶异戊醇(24∶1)、TE缓冲液(10 mmol/L Tris-Hcl pH8.0，1 mmol/L EDTA pH 8.0)、5 mol/L NaCl、液氮、50×TAE(2.0 mmol/L Tris-醋酸，100.0mmol/L EDTA pH8.5)、1×TAE(Tris-醋酸-EDTA)、1×固定液(10%乙醇，0.5%冰醋酸)、染色液(0.2%AgNO3)、显影液(1.5%NaOH，0.5%的37%甲醛)、10× Loading Buffer、0%的变性储存液：20 mL 40%丙烯酰胺，2 mL 50×TAE，78 mL ddH2O。100%的变性储存液∶20 mL 40%丙烯酰胺，2 mL 50×TAE，40 mL甲酰胺，42 g尿素，ddH2O补足100 mL。40%凝胶储液(丙烯酰胺∶甲叉丙烯酰胺=37.5∶1)、gel-red染色剂、琼脂糖、DNA Maker 2000(大连TaKaRa公司生产)。

3 实验方法

3.1 表面消毒

将植株的根和叶分开后，先用自来水清洗样品表面，除去表面附着物，再用无菌水淋洗 3次，在无菌条件下晾干。

3.2 提取组织总DNA (改良的CTAB 法)

(1) 取样品组织，用无菌剪刀剪成碎片后放入灭菌研钵中，加入液氮研磨成粉末。

(2) 取0.2 g 粉末至小管，加入65 ℃预热的CTAB提取液1 mL，置于65 ℃水浴2 h；然后加入等体积氯仿∶异戊醇 ( 体积比为24 ∶1) 抽提，10000×g离心10 min。

(3) 取上清至另一EP管，加入1/10体积的高浓度CTAB溶液，65 ℃水浴1 h。

(4) 获得DNA提取液加入等体积酚∶氯仿∶异戊醇 (体积比为25 ∶ 24 ∶ 1) 抽提，

10000 ×g 离心10 min，取上清。

(5) 加入等体积氯仿∶异戊醇(体积比为 24 ∶1) 抽提，10 000 ×g 离心10 min，取上清。

(6) 加入1/2体积NaCl (5 mol/L) 和2倍体积分数95%冰乙醇沉淀DNA，轻柔混匀，-20 ℃放置20 min。12000 ×g 离心20 min，弃上清。

(7) 用体积分数70%乙醇洗涤沉淀2次，待DNA干燥，加入30 μL TE缓冲液溶解DNA[12～14]。

3.3 DNA 质量检测

核酸蛋白测定仪测定纯度和浓度：取上述方法提取的基因组 DNA， 采用核酸蛋白测定仪测定总 DNA 的浓度及计算A260/A280 比值。

3.4 16S rDNA的V3区 PCR 扩增

以提取的基因组DNA为模板，16S rDNA可变区V3区为靶标，进行PCR扩增，上游引物：F357:(5’-CGCCC GCCGC GCCCC GCGCC CGGCC CGCCG CCCCC GCCCC CCTAC GGGAG GCAGC AG-3’)含GC夹子；下游引物：R518(5’-ATTAC CGCGG CTGCT GG-3’)[15]。PCR反应体系为：总反应体积为25 μL，其中包括Taq Mix 12.5 μL，引物各0.5 μL，模板1 μL，加双蒸水dd H2O至25 μL 。PCR反应程序为：94 ℃ 预变性4 min；94 ℃变性45s、55 ℃退火75s、72 ℃延伸1 min，共30个循环；最后72 ℃延伸5 min。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，在紫外凝胶成像系统下成像，保存图谱。

3.5 变性梯度凝胶电泳(DGGE)

采用 TD331-AP1 型梯度胶电动生成器进行 DGGE 凝胶电泳。制备8%聚丙烯酰胺凝胶，变性剂线性梯度范围为 35%～65%，1×TAE 缓冲液，先在150 V条件下预电泳 20 min，随后在85 V条件下电泳14 h，电泳结束后，硝酸银染色，用 Gel Doc XR + 凝胶成像系统采集图像，用Quantity one4.6.2软件分析结果[16]。

4 结果

4.1 DNA质量及PCR扩增结果

各样本基因组DNA的浓度在100～500 ng/μL之间，A260/A280 比值大约在1.8-2.1。将样本DNA统一稀释至40 ng/μL 浓度，进行PCR扩增。结果如图1所示，除了在中南民族大学采集的泽漆根样本外，其余的在217bp左右位置均出现目的条带。

图中1、2、3代表样本的采集地点，1号地是马鞍山森林公园，2号地是华中农业大学狮子山，3号地是中南民族大学。G代表根，Y代表叶

图1 6种植物的内生细菌的16S rDNA的V3区的扩增结果

4.2 DGGE电泳图谱

DGGE电泳图谱如图2所示，处于不同位置的每条 DNA带可能代表微生物群落中某一特定微生物种，其相对亮度代表其在群落中的相对丰度[17]，各个泳道条带多少和颜色深浅代表了各个植物内生细菌数量和含量的差异，也反映了各个植物内生细菌种群多样性的差异。从图2中可以看出，各个泳道的条带已经分开，优势特征条带明显，条带A是白英的的优势特征条带，条带B和I是巴天酸模的优势特征条带，条带C是葎草的特征优势条带，条带D是泽漆的特征优势条带，条带G是商陆的特征优势条带，条带E、F、H是野老鹳草的特征优势条带，每种植物优势条带的数量和位置均不相同。但同种植物不同器官间比较，条带1是巴天酸模的根特有的，条带2、3是泽漆的叶特有的，条带4、5所代表的菌落在商陆的叶中的含量比根中多，条带6所代表的菌落在野老鹳草的根里面的含量比叶中多，葎草中根的菌落丰富度大于叶。图2说明了不同植物间，内生菌群落种类有差异，但多样性差别不明显；每种植物不同器官、不同地点横向比较，发现同株植物不同器官中根的内生菌群落比叶多，但不同地点的内生菌群落条带位置及亮度相似度较高，可能与三地相邻较近有关，周围环境对植物内生菌群落影响不明显。

图中1、2、3代表样本的采集地点，1号地是武汉马鞍山森林公园、2号地是华中农业大学狮子山、3号地是中南民族大学

图2 6种植物不同地点不同器官内生细菌的DGGE图

4.3 聚类分析图

采用Quantity One 4.6.2软件的UPGMA算法进行聚类分析，以反映6种植物内生细菌的物种类型和丰度在总体水平上相似度的差异。结果如图3所示，其中，同种植物聚在一起，各成一簇，白英和野老鹳草，泽漆和巴天酸模，葎草和商陆又聚在一起组成3大簇，说明白英和野老鹳草，泽漆和巴天酸模，葎草和商陆的内生细菌相似度较高。同种植物相同器官不同地方的也能大致聚在一起，说明不同器官的植物内生菌有差异，而不同地方的差异不大。

其中泽漆的根和商陆1号地的根3个样本单独成一簇，说明泽漆的根和叶内生细菌差别很大，也可能是样本差异造成的。

4.4 多样性分析

采用QuantityOne软件对DGGE图谱进行菌落相似性和多样性分析。结果如表1，其中丰富度(S)、均匀度(EH)和多样性指数即Shannon 指数(H)等指标用来描述与比较各个样品的内生细菌多样性[18]。计算公式如下。

H=—∑Pi·lnPi

(1)

EH=H/Hmax=H/lnS

(2)

式(1)、(2)中Pi是样品中单一条带的强度在该样品中所有条带强度的比率。S为丰富度，即样品每一泳带的条带数目。S值越大，说明物种多样性越高。H值越大，说明群落多样性越高。

各样本的丰富度、均匀度和多样性指数结果见表1。由表1可见，白英的根和叶中内生菌多样性无明显差异，巴天酸模、葎草和野老鹳草根中内生菌的丰富度明显大于叶，说明这3种植物根的内生菌物种多样性大于叶。泽漆叶中内生菌的丰富度和多样性均明显大于叶，说明泽漆叶的内生菌物种多样性和群落多样性均高于根。而不同地点的同种植物之间差别并不明显。

表1 6种植物的内生细菌DGGE图谱多样性指数分析

续表1

样本多样性指数H用ⅹ± s表示丰富度S用ⅹ± s表示均匀度Eh用ⅹ± s表示3-葎-Y1.92100.831-泽-G1.661.79±0.1967±1.410.930.93±0.002-泽-G1.9280.931-泽-Y2.732.65±0.121717.33±0.580.960.93±0.042-泽-Y2.71180.943-泽-Y2.51170.891-商-G2.622.79±0.261820.33±4.930.910.93±0.022-商-G3.09260.953-商-G2.67170.941-商-Y2.942.97±0.052222.33±0.580.950.95±0.012-商-Y2.95220.953-商-Y3.02230.961-野-G2.913.06±0.3232226±10.580.940.95±0.022-野-G2.83180.983-野-G3.43380.941-野-Y3.053.02±0.042423.67±2.520.960.96±0.022-野-Y3.03260.933-野-Y2.98210.98

5 讨论

植物本身有其独特的微生态系统，对于药用植物而言，不同植株，不同产地，其药用价值不同，其中的微生物群落对药材的有效成分有着重要的影响，而影响植物生长的因素有很多，如地理位置、气候条件、光照、水分等，因此这些条件又间接影响植物的内生菌群落多样性，使得不同产地药材的有效成分产生差异。

本实验随机采取武汉3个不同地点6种常见植物，并对其根和茎的内生细菌的多样性进行了初步调查。研究发现同一地点的不同植物之间内生细菌种类与数量均存在较明显差异，每种植物都有其优势特征条带；同一地点的同一植物的叶与根的内生细菌种类存在较大差异，菌落数量也存在差异。相同植物不同地点的内生细菌群落(无论是叶，还是根)种类无明显差异，但存在菌落数量上的差异，这可能是由于3个采样的地点处于同一市区，气候环境相近所致。

现如今微生物领域的研究越来越得到人们的重视，随着科技的进步，未来对于植物内生菌的有效利用必不可少，人们可以明确分析出对药用植物有效成分起促进作用的植物内生菌并加以利用，对当地药材的产量、质量都有进一步改善[19]，在药用植物学领域具有广阔的前景。