观赏海棠中McmiR160a的克隆及调控红叶着色的功能分析

罗容丽，李雨欣，张 洁，张 杰，姚允聪

(农业应用新技术北京市重点实验室/植物生产国家级实验教学示范中心/北京农学院植物科学技术学院，北京 102206)

观赏海棠常色红叶品种‘王族’是常见的园林绿化树种，色彩艳丽，树型优美，广受众人喜爱。其叶片的红色是由于花色素苷的积累导致，花色素苷是植物色泽形成过程中最重要的组分之一[1]，花色素苷属酚类化合物中的类黄酮类，是一种水溶性色素，广泛存在于植物花瓣、果实的组织中及茎叶的表面细胞与下表皮层。

miRNAs(microRNAs)长度约21～23 nt，是一类单链小分子RNA。这类小RNA分子由长度约64～303 nt的前体(pre-miRNA)加工而成，而pre-miRNA则由更长的pri-RNA加工生成。miRNA是一类非常重要的转录后调控因子，在很多生物过程中起重要的调控作用。随着miRNA在不同生物中的大量发现，对其功能的研究已引起人们的极大兴趣[2]。

已有文献报道有些miRNA与植物体发育有关[3]，例如：pri-miR160响应SA下调，但由于赤霉酸，乙烯和茉莉酸甲酯正调控，从而影响龙眼的胚乳发育，表明pri-miR160与激素转导有关[4]。在拟南芥中，miR167及靶基因ARF4和ARF8受蓝光调控降低莲座叶数和叶面积，减少干物质生成，影响植株的生长发育[5]。miR393影响外源2,4-D对初级根的生长，同时miR393的过表达抵消铝诱导的根伸长抑制和减轻活性氧(ROS)诱导的细胞死亡[6]。近年来发现一些miRNA能够参与花色素苷代谢。据报道，苹果、番茄、葡萄、丹参中miR159，miR319和miR828家族也可以调控MYB转录因子[7]。拟南芥miR156和miR529通过5′RACE试验验证其与靶基因SPL9和SPL15的剪切方式，通过抑制靶基因SPL9和SPL15的表达，参与花色素苷代谢的调控[8]。在荔枝中，miR156的靶基因为SPL家族中的SPL1/2，使用酵母双杂交和BiFC分析表明LcSPL1蛋白可与LcMYB1蛋白相互作用，而LcMYB1是荔枝花色素苷生物合成中的关键调控基因[9]，从而证实miR156-SPLs模块在荔枝花色素苷生物合成的作用。

miR160a是一个高度保守的miRNA，在水稻中，miR160a抑制其靶基因ARF18，导致水稻的异常生长和发育[10]。miR160a-ARFs受生长素调节，主要参加激素代谢通道，施加外源生长素，ARF感知到生长素后，通过结合其调控区中的生长素应答元件(AuxRE)来激活或抑制大量生长素应答基因的表达。在拟南芥中，ARF18受外源生长素的正调控[11-13]。miR160a-ARFs模板在花色素苷代谢通道上的研究甚少，因此本研究通过对观赏海棠‘王族’中miR160a的前体进行克隆，并将其过表达载体瞬时转入‘王族’组培苗中，通过对花色素苷含量及花色素苷代谢途径关键基因的表达量进行分析，探究观赏海棠中miR160a对花色素苷代谢途径的调控作用。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验过程中所用材料为2018年春天采集的北京农学院东大地海棠资源圃自然生长的观赏海棠常色红叶品种‘王族’和北京农学院组培中心的‘王族’组培苗。采后迅速用液氮速冻，存于-80℃备用。

瞬时侵染试验采用北京农学院组培中心保存的海棠‘王族’。组培苗培养在MS培养基中培养(30%蔗糖+6.5 g/L 琼脂+0.4 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA；pH 5.8～6.0)。培养条件：温度23℃±1℃，相对湿度：70%～75%，光照强度：1 800 Lx，光照时间：长日照光照(16 h光/8 h暗)。

1.2 试验方法

1.2.1 植物总RNA的提取及cDNA的反转录 植物材料总RNA提取采用艾德莱EASY spin多糖多酚植物RNA快速提取试剂盒(RN3802)，提取‘王族’叶片中总RNA，采用全式金两步法RT-PCR试剂盒(AT401-01)。

1.2.2McmiR160a前体的克隆 由于苹果和海棠高度同源，使用NCBI找到苹果的MdmiR160a的基因信息，可知该序列所在基因组的染色体，是在10号染色体上的NC_024248.1位置，然后前体序列的上游取200～250 bp，下游取200～250 bp，加上前体序列本身构成一段400～500 bp左右的基因序列。通过Primer5设计正向引物McmiR160a-F：5′-CTTGGATTGAAGGGAGCTC-3′；反向引物McmiR160a-R：5′- GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。以‘王族’叶片cDNA为模板，反应体系为：cDNA模板2 μL、miR160a-F 1 μL、miR160a-R 1 μL、2×EasyPfu PCR SuperMix 25 μL、ddH2O 1 μL，反应条件为：95℃预变性3 min，94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 40 s，35个循环，72℃ 10 min，4℃保存。

将PCR产物进行琼脂糖凝胶检测，目的条带正确的基因片段用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒(博迈德：DH101-1)进行胶回收，回收后的目的基因产物连接至pEASY-Blunt载体上，进行涂板、转入大肠杆菌、挑选阳性克隆后测序。

1.2.3McmiR160a前体过表达载体的克隆 将测序正确的质粒与过表达质粒pCAMBIA1300-eGFP用限制性内切酶QuickCutXbaI(TAKARA:1634)和QuickCutkpnI(TAKARA:1618)双酶切，酶切体系为目的基因/载体10 μL/15 μL、QuickCutTMXbaI 1 μL、QuickCutTMKpnI 1 μL、10×QuickCut buffer 5 μL、ddH2O补充到50 μL，得到DNA小片段和质粒大片段，将目的基因、载体与T4DNA连接酶(TAKARA:2011A)轻轻混匀，离心后进行金属浴4℃连接过夜(16～24 h)，连接体系为：载体DNA 50 ng、插入DNA片段150 ng、T4 DNA连接酶1 μL、T4 DNA连接酶缓冲液2 μL、ddH2O补充到20 μL，然后转入大肠杆菌trans T1，送博迈德公司测序。将测序正确的质粒-20℃保存，并将测序正确的大肠杆菌加入50%甘油1∶1混匀后液氮速冻之后于-80℃保存。

1.2.4McmiR160a的瞬时转化

采用农杆菌冻融法将2 μL质粒DNA转入50 μL刚刚融化的农杆菌感受态GV3101细胞(实验室留存)中。培养并挑取单菌落进行PCR鉴定，正确的菌液进行大量培养后收集农杆菌菌体，加入侵染液(10 mmol/L MES+10 mmol/L MgCl2+200 μmol/L AS+无菌水)调菌液OD值到0.8～1.0左右。取继代培养20～25 d左右的生长良好无损伤褐化的‘王族’组培苗，采用真空抽吸的方法将菌液转入组培苗中，条件为0.5 Mpa持续30～40 s后，快速放气；至0.3 Mpa后，缓慢放气；至0.2 Mpa后，缓慢放气。然后用滤纸吸干组培苗表面的液体后，接种于固体培养基(MS培养基+头孢300 mg/L+卡那霉素50 mg/L)上，组培室中培养7～10 d后观察表型。

1.2.5 实时荧光定量PCR 实时荧光定量PCR参照SYBR© Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)试剂(购自大连宝生物工程有限公司)使用说明书，采用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR，qRT-PCR)两步法(95℃预变性3 min，94℃变性20 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40次循环)，以18S作为参照基因，所用所有荧光引物见表1，检测花色素苷合成途径相关的转录因子和生物合成基因的相对表达量。待测样品的数据均进行3次生物学重复。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.6 HPLC法测定花色素苷含量 将组培苗叶片在液氮下磨成细粉，称取1 g粉末加入1 mL花色素苷提取液(体积比是甲醇∶甲酸∶水=80∶1∶19)，之后在45℃的水浴中超声提取60 min(注意先预热到45℃)。将提取的所述花色素苷提取液进行纯化处理，使用离心机(12 000 r/min)离心10 min，得到上清液后，使用0.22 μm微孔滤膜对上清液进行过滤，并将剩余的滤液在-20℃冰箱中保存备用。将过滤后的上清液装于液相上样瓶中用于HPLC检测；对上样瓶进行HPLC检测，检测条件：样品温度15℃；柱温40℃；流速0.5 mL/min；进样量0.4 μL；流动相梯度，其中流动相A采用0.1%(体积比)甲酸水；流动相B采用色谱纯乙腈：0 min 10% B，4.5 min 19% B，9.5 min 32% B；10.5 min 35% B；11.5 min 65% B；14 min 95% B；柱子平衡时间1 min；平衡：14 min 95% B；15 min，10% B。检测波长：520 nm，350 nm；280 nm(甲酸、乙腈均为100%色谱纯，用水为18.2 mol/L去离子水)。

1.2.7McmiR160a的靶基因预测 通过靶基因预测网站psRNATarget (http://plantgrn.noble.org/v1_psRNATarget/)对McmiR160a的靶基因进行预测，通过NCBI比对，找到该基因的详细描述。

2 结果与分析

2.1 McmiR160a前体的克隆和过表达载体的构建

以观赏海棠常色红叶品种‘王族’叶片cDNA为模板，进行PCR扩增后得到长度为563 bp的McmiR160a前体序列(引物序列见表1)，经过1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，将目的片段进行胶回收后连接到pEASY-Blunt载体上，进行蓝白斑筛选挑取阳性克隆进行测序，将测序正确的质粒与过表达载体pCAMBIA1300用限制性内切酶XbaI和KpnI双酶切，并连接转化，将鉴定正确的质粒进行测序，得到McmiR160a过表达载体(OE-miR160a)，测序结果如图1所示。

图1 McmiR160a过表达载体序列比对Fig.1 Sequence alignment of expression vector McmiR160a

2.2 McmiR160a的靶基因预测

通过靶基因预测网站psRNATarget对McmiR160a的靶基因进行预测分析，得到与McmiR160a高度互补的并且假阳性较低的靶基因ARF18，其McmiR160a互补性如图2所示，可以看出只有在第一个碱基处有错配。将其比对到苹果基因组中的NCBI上，其在NCBI上的序列号为LOC103423002，属于ARFs家族，具有相对保守的结构，即包含一个保守的B3 DNA结构域，ARF结构域和Aux/IAA结构域。

图2 McmiR160a与ARF18互补性分析Fig.2 Complementary Analysis of McmiR160a and ARF18

2.3 McmiR160a的瞬时遗传转化

将McmiR160a过表达载体通过农杆菌转化法瞬时转入‘王族’组培苗，培养室中培养7～10 d观察表型，与对照相比，过表达McmiR160a转基因组培苗明显呈现绿色的表型(图3)。通过荧光检测后取样，对瞬时过表达McmiR160a植株中花色素苷含量进行测定，过表达植株中花色素苷含量明显低于对照组。对瞬时过表达McmiR160a植株中靶基因ARF18和花色素苷合成途径中的关键基因CHS、ANS、DFR、MYB10的相对表达量进行测定，过表达McmiR160a后，其靶基因ARF18的表达量下降，花色素苷合成关键基因的表达量都显著降低。说明McmiR160a可以负调控观赏海棠中花色素苷的生物合成(图4)。

图3 McmiR160a过表达表型图Fig.3 Phenotypic of OEmiR160a plants

图4 McmiR160a瞬时过表达植株中花色素苷含量及其结构基因表达Fig.4 Anthocyanin content and relative expression level of key genes in OEmiR160a plants

3 讨 论

近年来，miRNAs在参与植物生长发育以及应激环境胁迫等方面已有很多的研究进展。高蔗糖诱导的miR398以及miR408被高铜消除，这种蔗糖调节的铜处理是取决于SPL7的存在[14]。miR156通过靶基因SPL3调控PHT1;5或者诱导根际酸化作用参与P缺乏时的代谢调控[15]。而花色素苷不仅对植物组织的呈色，应对外界胁迫至关重要，同时还是一种重要的抗氧化物质，miRNAs对花色素苷以及植物生长发育发挥重要作用。

miR160在苹果中高度保守，其在miRbase数据库中收录的miR160前体有5种：miR160a、miR160b、miR160c、miR160d、miR160e。本研究主要通过在常色红叶观赏海棠‘王族’中进行miR160a的前体克隆，得到563 bp的前体序列，并通过双酶切的方式构建过表达载体pCAMBIA1300-miR160a，瞬时转入‘王族’组培苗中。使用HPLC法对转基因组培苗进行花色素苷含量测定，使用qRT-PCR对转基因组培苗进行花色素苷结构基因CHS、ANS、DFR、UFGT及转录因子MYB10的表达量进行测定。发现miR160a对花色素苷有着负调控作用。miRNAs主要是通过对下游靶基因的剪切抑制来发挥作用，miR160a的靶基因ARF18，属于生长素调节因子，主要参与激素代谢通路。在番茄中，miR160的主要靶标SlARF10a，调节生长素介导的花器官脱落和侧向器官叶片生长[16]。而花色素苷的调节受到各种激素的影响，其中包括生长素。在拟南芥中，施用3种外源生长素(IAA，NAA，2,4-D)，调节转录因子TT8，GL3和PAP1的表达以及花色素生物合成途径中的基因如DFR的表达来控制花色素苷的生物合成[17]。同时ARF18受外源生长素的正调控，因此ARF18可能对花色素苷有积极调控作用。本研究结果对miR160a及靶基因ARF18对花色素苷的具体调控作用提供一定的理论基础。