作物淀粉的三维荧光光谱指纹分析鉴定方法

张晋丹 吴明伟 冯曼

摘要：采用淀粉固体粉末进行荧光光谱测定，并对三维荧光光谱（EEMs）进行平行因子分析（PARAFAC），研究了水稻、高梁、玉米等单子叶作物淀粉的荧光组分特征，探讨了荧光组分特征与水稻品种的相关性。结果表明：不同来源的淀粉具有不同的荧光特性，可作为该物种淀粉的指纹图谱;籼稻荧光组分的荧光强度明显低于粳稻，经过单因素方差分析，可确定籼稻和粳稻的淀粉荧光组分强度具有显著差异，说明该方法可用于籼粳稻淀粉的鉴别。

关键词：淀粉;三维荧光光谱;平行因子分析;指纹图谱

中图分类号：0657.3;Q539+.1 文献标志码：A

引言

淀粉是植物的主要能量储藏物质，由直链淀粉和支链淀粉组成。直链淀粉是由葡萄糖残基以a-1，4糖苷键连接而成，基本上呈线型。支链淀粉由许多小的直链分子组成，不同的小直链分子间以a-1，6糖苷键连接，形成分支。直链淀粉和支链淀粉所占比例以及支链淀粉的分支度决定淀粉的品质和用途。研究表明，淀粉是一种荧光物质，不同来源作物的淀粉结构存在较大差异，构成不同作物特征性淀粉荧光指纹图谱。

三维荧光光谱（EEMs）技术作为一项有效的化学分析手段，具有速度快、取样量少、信息量大、灵敏度高等特点，在水质分析、绿茶成分鉴定、黄曲霉毒素等检测中发挥着重要的作用。平行因子分析（PARAFAC）方法是一种针对三维复杂数据的分析方法，能够最大限度表征样品中所有的荧光信息，将荧光信号分解成相对独立的荧光矩阵，提高了分析的准确性。目前三维荧光光谱技术结合平行因子分析方法已经成为研究水环境中有机物溶解动力学特征的重要工具。由于淀粉不溶于水和有机溶液，文献【3】采用淀粉悬液进行荧光光谱测定，但光谱的均一性问题限制了淀粉荧光分析方法的普遍应用。

本文采用淀粉固体粉末进行荧光光谱测定，对三维荧光光谱进行平行因子分析，研究水稻、高粱、玉米等单子叶作物淀粉的荧光组分特征，建立不同作物的荧光指纹图谱，并初步探讨了荧光组分特征、表观直链淀粉含量（AAC）及水稻品种的相关性。

1测量方法

1.1三维荧光光谱测量

收集不同地区水稻品种53份、高粱品种14份、玉米品种18份。将成熟水稻种子加工成精米后粉碎，再经37℃烘烤1周后过100目筛子，备用。将高粱和玉米直接粉碎，37℃烘烤一周后，过100目筛子，备用。

采用日立公司F-7000荧光光度计进行三维荧光光谱测定，配以固体支架（零件号：650-0161），扫描速度为2400mm/min，激发和发射单色仪的狭缝设定为5mm，激发波长和发射波长的范围为200～900mm，步长为10mm。将采集到三种植物的三维荧光光谱数据存储在Excel表中，并存储为f1.CSV形式。采用DOMFluor工具包在MATLAB 2007a软件上对待测样品三维荧光光谱数据进行平行因子分析，分析中设置非负性限制，去除瑞利和拉曼散射，并去除离群样品，对剩余样品的三维荧光光谱数据构建成相应作物的淀粉荧光组分数据库。荧光组分的数目由折半分析法确定（split-half analysis），每一荧光组分的特征由组分EEMs表示，每个荧光组分在每个样品中的荧光强度以Fmax（RU）表示。

1.2水稻精米粉表观直链淀粉含量测定及统计分析

准确称量10mg精米粉置于2mL离心管，加入100ul的无水乙醇，震荡混匀，再加入900ul浓度为1 mol/L的氢氧化钠溶液，震荡混匀后放入30℃培养箱静置16 h使精米粉糊化。4份水稻不同表观直链淀粉含量的标准样品（1.5%，10.2%，16.2%，26.4%）购于中国农科院水稻研究所（杭州），对这4份水稻按同样的方法同时进行糊化。

经糊化后的樣品溶液与1 mL去离子水震荡混匀，取10ul稀释后的糊化溶液与990ul碘/碘化钾溶液（20/0）混匀静置20 min;然后吸取200ul反应液加入96孔透明细胞培养皿中，利用酶标仪（infinite M200 PRO）进行测定，测定波长为680 nm。采用SPSS软件进行相关性分析，以及单因素方差分析。

2结果与讨论

2.1水稻精米淀粉的荧光组分

根据PARAFAC模型，识别出水稻精米淀粉中有4个荧光组分（component，c），其中c1和c2为强荧光组分，如图1所示，图中Ex为激发光谱，Em为发射光谱。组分c1和c2包括单一发射峰和2个激发峰，组分c1（200，280/310 nm），组分C2（250，360/440nm）。组分c3和C4是弱荧光组分，含有2个激发峰和3个发射峰，组分C3（290，430/455，570，880nm），组分C4（270，410/480，550，820 nm）。

2.2高梁淀粉的荧光组分

根据PARAFAC模型，识别出高粱淀粉中有4个荧光组分，其中c1和c2为强荧光组分，如图2所示。组分c1和c2包括单一发射峰和2个激发峰，组分C1（200，270/290 nm），组分C2（250，340/420 nm）。组分c3和C4是弱荧光组分，含有2个激发峰和3个发射峰。组分C3（270，400/430，520，800 nm），组分C4（290，430/430，560，860 nm）。

2.3玉米淀粉的荧光组分

根据PARAFAC模型，识别出玉米淀粉中有4个荧光组分，其中c1和c2为强荧光组分，如图3所示。组分c1和c2包括单一发射峰和2个激发峰，组分C1（200，270/310 nm），组分C2（240，360/440nm）。组分c3和C4是弱荧光组分，含有2个激发峰和3个发射峰，组分C3（270，400/430，530，810nm），组分C4（290，430/450，570，880 nm）。

从3种作物的三维荧光光谱可以看出，不同来源淀粉的特征性荧光组分存在偏移和重叠现象。相对于高梁和玉米，水稻淀粉组分c2的荧光信号较弱。高粱淀粉组分c2的发射波长为420 nm，水稻和玉米淀粉组分c2的发射波长为440 nm。水稻组分c3的激发和发射波长发生红移等。因此，通过比较这些特征性荧光组分的波长和荧光强弱可以区分不同来源的淀粉。

2.4水稻荧光组分强度分布与亚种的相关性

为了研究淀粉荧光组分与水稻亚种的相关性，我们分析了不同水稻品种的荧光组分强度和粳籼稻亚种的相关性，不同水稻的荧光强度测定结果如表1所示。研究表明，籼稻荧光组分的荧光强度明显低于粳稻的，经过单因素方差分析，确定籼稻和粳稻的淀粉荧光组分强度具有显著差异，其中荧光组分2显著性p值小于0.01、荧光组分3显著性p值小于0.01、荧光组分4显著性p值小于0.05，如表2所示。

2.5水稻荧光组分强度分布与表观直链淀粉含量的相关性

直链淀粉含量是水稻重要的品质性状之一，一般用表观直链淀粉含量（AAC）来表征。为了确定荧光组分和直链淀粉的相关性，进一步测定了这些品种的表观直链淀粉含量（AAC）如表3所示，分析了水稻荧光组分强度与表观直链淀粉含量（AAC）的关系。经SPSS软件统计分析，Pearson相关系数低于0.2，显著性p值双侧大于0.05，说明两者之间没有相关性，如表4所示。

3结论

本文建立了固体样品淀粉荧光光谱测定方法，并通过指纹图谱区分不同来源的淀粉。这种测定方法不但可以避免淀粉荧光测量时面临的溶质不均性问题，而且可以避免有机溶液产生的背景荧光，提升了测定方法的灵敏度和结果重现性。另外相对于主成分分析等二维数据分析方法，利用平行因子分析方法进行三维数据分析，其解是唯一的，也可以避免主观因素造成的分析结果差异。因此，作为一种新的淀粉测试分析方法，本研究能够为不同来源的淀粉鉴定提供参考。