人源诱导多潜能干细胞在心血管疾病研究中的应用与挑战

田 蕾 柳金英 白 蕊 吴福建 张惠敏 谢 璇 苏聪平 王 青 郭淑贞 王 伟 兰 峰

2017年的《中国心血管病报告》显示，中国心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）的患病率和病死率仍处在上升阶段，CVD死亡占居民死亡构成的40%以上，现患人数约2.9亿，心血管疾病的治疗仍面临严峻挑战，成为当今社会的重大公共卫生问题。心血管疾病所造成的心肌损伤表现出具有正常收缩功能的心肌细胞数量的相对或绝对减少，受损的心肌细胞通过纤维组织瘢痕修复，未受损的心肌细胞出现代偿性肥大，造成心肌收缩功能下降，最终导致心力衰竭。在这过程中心肌细胞的再生能力受限成为制约心血管疾病治疗的瓶颈，利用干细胞修复衰竭的心肌细胞为突破这一瓶颈带来希望。

干细胞根据其不同的来源与分化能力，可分为成体干细胞与胚胎干细胞，其最显著的特征是具有无限增殖和分化为多种细胞类型的潜能，但胚胎干细胞主要来源自早期发育的胚胎，在使用过程中受到伦理学限制，此外，在临床实践中，患者在应用由干细胞分化的细胞或组织后，需要终身服用免疫抑制剂以对抗自身排斥反应。诱导多潜能干细胞的出现打破了干细胞应用的中的局限，诱导多潜能干细胞简称iPSC，是人体的体细胞经过重编程后获得的具有自我更新和多能分化能力等类似胚胎干细胞的生物特性的一种细胞。2006年，日本Yamanaka团队首次通过4个转录因子Oct4、Sox2、c-Myc与Klf4转染到小鼠的成纤维细胞中，成功的获得了类似胚胎干细胞的多潜能干细胞，从而建立了小鼠诱导多能干细胞系[1]。2007年，Takahashi等通过对人皮肤成纤维细胞进行重编程，获得人源诱导多潜能干细胞（human induced pluripotent stem cells，hiPSC）[2]。《Science》杂志将该项研究成果列为2008年世界十大科技突破的第二位。诱导多能干细胞不仅避免了在伦理、道德、宗教、以及免疫排斥等方面的诸多问题，此外还克服了既往对疾病研究中由于机制复杂及相关细胞组织难以获得而使研究举步维艰的困难。目前的研究显示，iPSCs在心肌损伤的修复，心血管相关的模型的构建以及药物心血管系统药物安全性评价等方面展现出特有的优势和应用前景，本文将从这三个方面展开介绍。

1.人源诱导多潜能干细胞分化心肌细胞

Kehat团队[3]最初报道，通过拟胚体和使用含有血清的培养基分化出心肌细胞，但其分化效率仅为5%～10%。之后的研究就分化效率的提高进行深入探索，Mummery等[4]报道了成功通过与小鼠内胚层样细胞（END2）共培养以增强分化效率。使用细胞因子如激活素A（activin A）和BMP4（bone morphogenetic protein 4）在基于胚状体的分化中实现了更高效的诱导心肌细胞[5-6]。2009年，Zwi团队[7]成功的将hiPSC分化出可跳动的、具有正常细胞形态及电生理特性的心肌细胞。随后多种成分及功能明确的化学小分子诱导分化的方法渐趋成熟。2014年，研究通过调控经典的Wnt信号通路的“CDM3”分化体系，在不使用血清的情况下，成功的将hiPSC分化心肌细胞，且心肌细胞的纯度为90%～95%[8]。而通过去除培养基中的谷氨酸与葡萄糖成功分化出纯度超过99%的心肌细胞[9]。

从iPSCs分化出心肌细胞，可以自主收缩，随着心肌细胞的发育成熟具备良好的肌节结构及心肌特异性的动作电位和钙瞬变并表达肌浆网蛋白和离子通道的特点。此外，研究人员使用多种方法，如延长培养时间、电刺激、机械刺激、流体力学以及改良培养基等，促进iPSCs来源的心肌细胞成熟。2018年，哥伦比亚大学的Kacey团队开发出一种全新的方法，在仅持续4周的生物反应器培养下利用血液衍生的iPSCs培育出类似成年的人心肌组织。他们将通常需要9个月的发育时间压缩到比其他研究更快更完整的经历心脏成熟，分化成熟的心肌细胞胞核增多、肌节成熟，T管形成，心肌收缩的频率、幅度、能量代谢的转变及钙处理等均与成人的心肌细胞高度一致[10]。这些方法均为iPSCs分化的心肌细胞的应用提供质量保证。

2.人源诱导多潜能干细胞分化的心肌细胞对心肌损伤的修复

自2006年，发现iPSCs以来，其在包括各种心血管疾病在内的多种疾病的潜在治疗应用价值受到广泛关注。2014年，对患有年龄相关性黄斑变性的患者进行了世界上第一个自体iPSCs衍生细胞的移植，在移植后的第一年，在没有应用免疫抑制剂的情况下，没有出现畸胎瘤形成或移植的iPSCs衍生的视网膜上皮（RPE）细胞的免疫排斥迹象[11]。这无疑鼓舞着iPSCs的临床应用。诱导多潜能干细胞对心肌损伤的修复主要表现在其对心肌梗死或心肌缺血后心肌损伤的修复，预期移植干细胞分化的心肌细胞通过对心肌细胞的收缩功能和营养作用改善心脏功能。对于前一个目的，移植细胞和宿主心肌的电生理整合非常重要。而营养效应主要归因于移植细胞分泌因子，如生长因子。Shiba等[12]通过豚鼠模型实验发现，移植胚胎干细胞源的心肌细胞能够与周围宿主心肌形成间隙链接，并实现1∶1宿主偶联。Chong团队[13]通过将10亿个人胚胎干细胞来源的心肌细胞注射入心肌缺血的灵长类动物猕猴的心肌内，观察2～7周后发现，外源性的心肌细胞能移植入心肌内，并实现肌化与肌电同步。使用人胚胎干细胞衍生的心肌细胞能够在免疫抑制剂治疗后的心梗动物模型的心脏中成功移植。

Kawamura等[14]报道使用猪心肌梗塞模型移植由来自人类iPSCs分化的心肌细胞，可以显著改善急性心肌梗死清晰度动物模型的心脏功能。Lei等[15]通过将200万个计量的人源诱导多潜能干细胞分化的心肌细胞、内皮细胞与平滑肌细胞注入到心肌损伤模型猪的心脏，发现iPSCs源的细胞不仅可以植入到模型猪的心脏中，并且能在维持心率正常的情况先下，显著改善心肌损伤造成的心肌凋亡，改善左心室功能及心肌代谢功能等。2015年，Menasche团队[16]首次报道了成功运用人胚胎干细胞来源的心肌祖细胞移植到晚期缺血性心力衰竭患者的心脏中。综上，考虑到来源iPSCs的心肌细胞的显著优势，其临床应用前景广阔。

3.人源诱导多潜能干细胞分化的心肌细胞在心血管疾病模型中的应用

人与小鼠的心肌细胞电生理特性存在显著差异，小鼠的心肌细胞具有较短的动作电位时程和较快的心率（≈600次/min），这些差异是小鼠模型无法充分再现人类心血管疾病的重要原因，而人原代的心肌细胞又难以在体外稳定的取样和保持，而来自患者体细胞诱导的iPSCs分化的心肌细胞，具备人体整套的遗传背景，能够建立患者特异性的疾病模型，较动物细胞相比，可以更好的应用于人类疾病的研究。

基于iPSCs的疾病模型的最早报道之一是长QT综合征（long QT syndrome，LQT），长QT综合征是由复极相关的离子通道基因突变引起，患者心电图表现出QT间期延长，增加致命性室性心律失常的风险。目前发现的遗传性LQT有13种亚型，已经报道的基于iPSCs的长QT综合征疾病亚型的模型有LQTS1[17-19]，LQTS2[20-23]和LQTS3[24-25]，首先被报道的是LQTS1，该亚型是由KCNQ1（KCNQ1-190Q）突变引起的，KCNQ1（KCNQ1-190Q）为编码慢速延迟整流外向钾通道IKsa亚单位的基因，从KCNQ1突变患者源的IPSCs分化的心室肌细胞电生理检测显示出延长的动作电位时程，IKs电流降低，使用IKs阻滞剂后未见改善，进一步证实了其IKs通道异常[17]。此外，有关LQTS2亚型的文章报道，由于2型长QT综合征是由（KCNH2-A614V突变引起的，KCNH2参与编码快速激活延迟整流钾通道IKr的α亚单位基因，运用伴有KCNH2突变的iPSCs分化的心肌细胞，其电生理检测显示动作电位时程延长，IKr电流降低，对突变的基因进行基因敲减可以纠正电生理异常[23]。此外，由SCN5A负责编码钠内流通道亚单位的基因突变造成的钠通道异常是LQT3的主要病因，2013年，Terrenoire和Ma团队，分别成功的使用患者特异性的iPSCs构建了LQTS3疾病模型[24-25]。另外基于iPSCs疾病模型研究还包括Timothy综合征[26]，该疾病是由负责编码CaV1.2的L型钙通道的基因CACNA1C突变引起，该病患表现出QT间期延长，自闭症和免疫缺陷等一系列病症，使用带有CACNA1C突变的IPSCs分化的心室肌细胞的电生理检测结果显示动作电位持续时间延长和频繁的延迟后去极化，L-型钙通道失活受损，导致该通道功能亢进，使用促进CaV1.2失活的化合物roscovitine后能显著缩短心室肌细胞的动作电位持续时间。

此外，患者特异性的iPSCs也被用于体外构建心肌病疾病模型，最早的报道之一是有关LEOPARD综合征的研究[27]，该疾病的主要的临床表现包括肥厚型心肌病、肺动脉瓣狭窄、生长迟缓及耳聋等，LEOPARD综合征是由PTPN11基因突变引起的，该基因是一种蛋白酪氨酸磷酸酶，在RAS/MAPK信号通路上发挥重要作用，患者源的IPSCs分化的心肌细胞表现出细胞形态增大和NFATC4的核异位，这些与肥厚性心肌病的细胞变化一致，另外，心肌细胞还表现出ERK和MEK的磷酸化上调。而基于扩张性心肌病患者iPSCs分化的心肌细胞，表现出肌小节紊乱、收缩功能下降及钙通道异常等一系列与扩张型心肌病一致的细胞特征，运用美托洛尔可以改善扩张型心肌病患者iPSCs分化的心肌细胞在TNNT2点突变的疾病表型[28-31]。致心率失常性右心室心肌病是另一种以患者iPSCs构建的心肌病疾病模型，伴有PKP2点突变的患者成纤维细胞源iPSCs分化的心肌细胞在正常的培养条件下未表现出病理学表型，但当培养基中补充了限定因子诱导脂肪生成途径激活后，心肌细胞不仅表现出脂肪生成的增加还表现出心肌细胞的凋亡，该研究也表明诱导成人体内新陈代谢条件可以促进体外细胞模型的疾病表型的表现[32]。

其他类型的基于患者源的iPSCs构建的心血管疾病模型还包括Barth综合征，Barth综合征是由TAZ基因突变导致的，该突变在线粒体结构中起重要作用，突变的TAZ引起线粒体结构和功能的异常，研究证实源自Barth综合征患者iPSCs衍生的心肌细胞显示线粒体功能障碍，收缩功能异常及活性氧增高，加入线粒体靶向的抗氧化剂mito TEMPO可以纠正Barth综合征患者iPSC源的心肌细胞异常[33]。

综上所述，现代研究不仅证明使用患者源的iPSCs分化的心肌细胞构建疾病模型的可行性，还为治疗基因突变导致的心血管疾病的治疗提供了新的见解。

4.人源诱导多潜能干细胞分化的心肌细胞在心血管疾病药物安全性评价中的应用

基于安全性考虑，约30%的潜在候选药物在临床开发阶段中止，其中大部分是因为心血管不良反应而排除在外，近年新上市药物如Avandia、马来酸罗格列酮等，因为患者服用后产生了严重的心脏毒副作用，而被紧急撤回[34]。可见，药物的心脏毒性是制约药物研发的难题，也是药物临床前安全评价研究的重要问题。由于药物引起的心脏毒性的实际风险是由多个心脏通路调控的，因此如目前采用的稳定表达hERG的细胞系（即KCNH2，编码IKr通路）来鉴定具有阻断IKr电流倾向的化合物安全性评价可能不足以描述实际的风险。缺乏特异性也可能导致高估药物的实际心脏毒性，终止潜在有效的新药研发。iPSCs源的心肌细胞有助于解决这些局限，大多数在成人心肌细胞中出现的电流可以在iPSCs分化的心肌细胞中重现。2011年，Gou等[35]报道运用单层搏动的iPSC-CM建立体外高通量筛选模型，精确的对药物引起的心脏功能异常进行了精确的检测，即通过带有微电极阵列的96孔板，检测iPSC-CM同步收缩的频率、节律以及幅度，通过该筛选模型评价了28种已知具有心脏毒性的化合物，研究结果证实该模型能够灵敏、精确的检测出该化合物的特异性心率改变及振幅改变。iPSC-CM模型的建立开拓了药物体外心脏毒性检测的新领域，该模型能够更加全面、特异性地检测药物的心脏毒性。近年来，多潜能干细胞分化的心肌细胞在心脏毒性筛选中的应用越来越广泛。Eldrige等[36]通过运用ErbB信号通路的抑制剂和激活剂处理的hiPSC来源的心肌细胞，能够缓解或加重多柔比星诱导的心肌损伤。2016年，Paul[37]团队运用接受阿霉素治疗的乳腺癌患者的iPSCs分化的心肌细胞，分别从心肌细胞的结构、心肌细胞的收缩功能、线粒体膜电位、氧化应激等方面全面系统的评价阿霉素的心脏毒性。为阿霉素心脏毒性的药理机制提供了坚实的实验证据。iPSCs分化的心肌细胞相当于胚胎心肌细胞，针对药物的安全性测试，心肌细胞需要显示出于成人心肌一致的药物反应，因此研究人员不断提高心肌细胞的成熟程度以提高iPSCs源的心肌细胞对药物心脏毒性预测水平，随着iPSCs分化成熟心肌细胞的技术不断完善，其将在心血管药物的研发、筛选及早期毒性评价发挥重要作用[38]。

5.挑战与展望

综上所述，近年来，hiPSCs源分化的心肌细胞广泛运用于心血管疾病模型的制备、疾病机制研究、疾病治疗以及药物筛选等方面。但hiPSC源的心肌细胞的应用仍面临许多问题：首先，就其在损伤心肌的修复作用的研究中发现未转化的干细胞对机体存在损害，容易产生免疫排斥，研究发现来源自某种遗传背景的ES细胞当移入遗传背景相同的实验动物后，会产生畸胎瘤，即出现免疫耐受。此外，干细胞作为一种外源性的物质移植入心脏是否能引起致命性的心率失常尚存有争议，目前发现iPSC移植可发生室性早搏，但发生率并不显著，目前主要考虑可能与移植IPSC后分布密度不均及注射过程中的不良刺激有关。此外，hiPSC疾病模型的制备及药物筛选中的运用也存在一定的局限，尽管iPSCs衍生的心肌细胞能更真实的模拟机体的心肌细胞功能，但针对涉及多种细胞类型且机制复杂的心血管疾病，更需要构建组织或者器官水平的疾病模型，虽然通过hiPSC可以分化出上皮细胞以及平滑肌细胞，但模拟心脏组织还很难实现。最后，目前hiPSC获得的心肌细胞主要为心室肌细胞，只包含较少的心房肌细胞与窦房结细胞，对分化出高纯度亚型特异性的心肌细胞技术还需进一步研究完善。希望随着基因编辑以及组织工程技术的发展，hiPSCs分化心肌细胞的研究也不断深入，早日构建出表型成熟和亚型特异的心肌细胞模型，更好的应用在心血管疾病的基础研究与临床实践中。