不同产地厚朴的蛋白质指纹图谱研究

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(武汉工商学院环境与生物工程学院，湖北 武汉 430065)

厚朴为木兰科植物厚朴(Magnolia officinalis Rehd.et Wils)，或凹叶厚朴的干燥干皮、根皮及枝皮。味苦、辛、性温，归脾、胃、肺、以及大肠经，具有燥湿消痰，温中下气除满的功效，临床主要用于湿滞伤中，腕痞吐泻，腹胀便泻，痰饮咳喘以及食积气滞等[1]。其主要产地位于四川、浙江、广西、湖北、湖南等地。在中成药中，采用厚朴配方的多达200多种[2]。聚丙烯酞胺凝胶电泳与其它分析手段相比具有分辨率高、性能稳定、样品不易扩散、凝胶孔径可调等优点，是目前最常用的蛋白质分子分离、分析手段。根据以上优点，可对中药进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，以电泳图谱来标示中药种的特性[3]。厚朴饮片的指纹图谱研究对其真伪的鉴定以及区分不同产地的厚朴饮片提供了有利条件[4-6]。

本研究考察了不同产地厚朴饮片的电泳指纹图谱研究，对厚朴饮片中的蛋白质提取进行鉴定。通过对提取液量、超声破碎时间、超声破碎功率、超声破碎时间间隔进行单因素实验以及正交试验得出厚朴饮片提取蛋白质的最佳方法。最后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析的结果，比较不同产地厚朴饮片的蛋白质含量及分布的差异。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

研究材料：本研究所用不同产地厚朴药材分别购于湖北省恩施GAP示范基地、四川、重庆等地，经湖北中医药大学鉴定教研室张林碧教授鉴定为木兰科植物厚朴(Magnolia officinalis Rehd.Et Wils.)的干燥树皮、根皮和枝皮，俗称“紫油厚朴”。

试剂：TEMED(国药集团化学试剂有限公司)，丙烯酰胺(天津市科密欧化学试剂有限公司)，冰乙酸、溴酚蓝(天津市风船化学试剂科技有限公司)，甲叉双丙烯酰胺(Fluka分装)，磷酸(天津市天力化学试剂有限公司)，TRIS碱(DOW Chemical Company)，甘氨酸(BIOSHARP)，考马斯亮蓝G-250(Sanland Chemical Co,LTD)，过硫酸铵(天津市凯通化学试剂有限公司)，以上试剂均为分析纯。

仪器：GZX-9070M型超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)，JY600型电泳仪、DYCZ-40D型电泳槽(北京六一仪器厂)。

1.2 试验方法

1.2.1 样品制备

取湖北恩施利川厚朴饮片粉末1g，加20mL的样品缓冲液后按照最佳提取蛋白质的条件，超声破碎提取30min，超声间隔6s，功率250W。经超声破碎后于4℃条件下，3500r/mim离心20min，取上清液于EP管中，4℃保存备用[7]。

1.2.2 凝胶的制备

表1 蛋白质电泳凝胶的配制

根据参考文献[8]，按表1配制5%的浓缩胶和10%的分离胶，灌胶。

1.2.3 上样与电泳

用20μL移液枪分别吸取20μL样品与20μL 40%蔗糖溶液于洁净的EP管内，用移液枪吹打混匀后，沸水煮沸5min，用20μL微量进样器吸取20μL缓缓注入样品槽内。样品添加完毕后开始电泳，电泳开始阶段控制电压80V，待样品全部到达分离胶后，调整电压至120V。待溴酚蓝指示剂到达距分离胶底部约1cm时，关闭电源，停止电泳。整个过程约3～4h。

1.2.4 染色与脱色

电泳结束后，取出凝胶板，小心分开上下两块玻璃板，取出凝胶，用直尺刮去浓缩胶，保留完整的分离胶并标记溴酚蓝前沿。将凝胶浸于考马斯亮蓝G250染色液中，染色20min左右。染色后浸于脱色液中脱色，并经常更换脱色液，至背景清晰。

1.2.5 蛋白质电泳图谱分析

将染色后的凝胶用蒸馏水冲洗后小心平铺于凝胶紫外成像分析仪内，调整好位置以便于拍照。打开Gel-Pro analyzer分析软件，点击拍照按钮拍照，由于蛋白质电泳图谱是可见的，所以需要适当减少曝光率至条带清晰。拍照后保存图片于电脑中，继续用Gel-Pro analyzer软件的1D-Gel分析系统，进行条带捕捉，以各谱带光密度值OD值为纵坐标，泳道中各谱带的泳动距离Rf值为横坐标，绘制各谱带泳动率图谱[9]。

2 结果分析

2.1 蛋白质电泳指纹图谱分析

pro-PAGE蛋白质图谱见图1，由图可以看出个不同产地的厚朴饮片蛋白质PAGE图谱均有明显的条带，且条带的位置和条带形状没有明显的差异，其中2、4、5、条带显示较弱，可能是这几种厚朴样品中杂质较多，导致其提取的蛋白质浓度较低，致使其条带不够明显。

1、2.湖北恩施利川厚朴饮片;3.蛋白质marker;4.重庆南川厚朴; 5.为四川都江堰厚朴;6.湖北恩施双鹤厚朴;7.湖北恩施利川厚朴 图1 蛋白质电泳指纹图谱

2.2 泳动率图谱分析

Lane1、2湖北恩施厚朴饮片;Lane3蛋白质marker;Lane4重庆南川厚朴;Lane5为四川都江堰厚朴;Lane6湖北恩施双鹤厚朴;Lane7 湖北恩施利川厚朴 图2 不同产地厚朴饮片蛋白质谱带泳动率图谱

将胶板用凝胶成像紫外分析仪进行成像，用Gel-Pro analyzer软件对各谱带进行分析。以各谱带光密度值OD值为纵坐标，泳道中各谱带的泳动距离Rf值为横坐标，绘制各谱带泳动率图结果见图2。由图2可以看出，Lane1、2、6、7同种产地的厚朴饮片的泳动率差异很小，其峰高、出峰点以及峰面积都几乎一致。蛋白质是植物基因表达的产物，不同产地的厚朴饮片的蛋白质电泳图谱几乎一致说明的这几种不同产地的厚朴饮片均为同一品种，证实了不同产地同种物种遗传物质蛋白质的稳定性。Lane4、5不同产地的厚朴药材的泳动率有明显的差别，其峰高、出峰点以及峰面积都不一样，可以辨别出不同产地的厚朴药材。说明不同产地厚朴饮片含有不相同类型的蛋白质，证明蛋白质电泳可以部分分辨不同产地的厚朴饮片。

3 结论

蛋白质的提取是中药指纹图谱构建中重要的一环，在实验最开始的蛋白质电泳中，由于提取出的蛋白质含量过低，导致无法跑出达到要求的电泳图谱。因此进行三因素三水平的正交试验选出最佳的提取条件：超声破碎时间40min，超声破碎时间间隔4s，超声破碎功率360W，提取液量17.5mL，蛋白质提取浓度达到最大为4.98μg/mL。查阅相关文献可知达到了蛋白质电泳的含量要求。

通过将提取的蛋白质进行电泳实验，得到蛋白质电泳，可以部分分辨出不同产地的厚朴饮片，不同产地厚朴饮片蛋白质条带对应的泳动率差异非常小，可以区别不同产地的厚朴饮片为不同一品种。