超高效液相色谱法测定门冬胰岛素含量

2019-02-21栗凤娟

中国药业 2019年4期

梅丽，栗凤娟，杨桦

（江苏万邦医药科技有限公司，江苏徐州 221004）

胰岛素是治疗糖尿病的有效药物[1]，但普通胰岛素因存在作用时间短、吸收变异大、作用峰值明显、低血糖发生率高等诸多问题，日益被胰岛素类似物取代[2]。门冬胰岛素临床用于治疗糖尿病[3]，于2000年在美国批准上市[4]，其与常规胰岛素相比可更快地控制血糖，对1型与2型糖尿病有良好的疗效，市场前景广阔[5-6]。与传统的高效液相色谱（HPLC）法相比，超高效液相色谱（UPLC）法填料颗粒小、均匀，具有柱效高、分析速度快、分离度高、灵敏度好等特点[7-8]，因此被广泛应用于生物化学、药物研究分析等领域[9]。本研究中采用UPLC法测定门冬胰岛素的含量，为提升其质量标准提供依据。

1 仪器与试药

仪器：LC-30A型高效液相色谱仪，包括SPD检测器（日本 Shimadzu公司）；FE20型酸度计、XS105型电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

试药：门冬胰岛素对照品（中国食品药品检定研究院，批号为 410011-201501，效价为 27.5 U／mg）；门冬胰岛素（江苏万邦生化医药集团有限责任公司，批号为E0301）；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Shim-pack GISS C18柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；流动相：0.2 mol／L Na2SO4溶液(取无水硫酸钠 28 g，加水 900 mL溶解，加 85%磷酸溶液 2.7 mL，用乙醇胺调 pH 至 3.6，加水至 1 000 mL，经 0.45 μm微孔滤膜滤过，即得)-乙腈（72 ∶18，V／V，A）-50%乙腈(B)，梯度洗脱（0～10 min，65%A；10～23 min，65%A→20%A；23～25 min，20%A→65%A；25～30 min，65%A）；流速：0.25 mL／min；检测波长：214 nm；柱温：40 ℃；进样量：2 μL。

2.2 溶液制备

取门冬胰岛素对照品约10 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，加0.01 mol／L盐酸溶解并定容，制成质量浓度为1.0 g／L的溶液，室温放置，使B3Asp门冬胰岛素和A21Asp门冬胰岛素的含量不低于1%，作为系统适用性溶液。取门冬胰岛素对照品10 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，用0.01 mol／L盐酸溶解并定容，制成每1 mL含 1.0 mg（约 10 U）的对照品溶液。取样品约 10 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，用0.01 mol／L盐酸溶解并定容，摇匀，即得供试品溶液。以0.01 mol／L盐酸溶液作为阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验：取2.2项下3种溶液各适量，按拟订色谱条件进样测定，记录色谱图，详见图1。结果阴性对照品溶液色谱在与对照品溶液色谱相同保留时间处无干扰峰，表明专属性良好。

图1 超高效液相色谱图

线性关系考察：取门冬胰岛素对照品50.05 mg，置25 mL容量瓶中，用0.01 mol／L盐酸溶液制成质量浓度分别为 0.7，0.9，1.0，1.1，1.3 g／L 的系列对照品溶液，按拟订色谱条件进样测定，以门冬胰岛素质量浓度（X，g／L）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程 Y＝ -10 468X＋36 966，R2＝0.999 99（n＝5）。结果表明，门冬胰岛素质量浓度在 0.05～1.30 g／L范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：取对照品溶液适量，按拟订色谱条件进样测定，平行 6次，记录峰面积。结果的 RSD为0.02%（n ＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取供试品溶液适量，定容，室温放置，分别于 0，2，4，6，8，10，12，24 h 时按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积。结果的 RSD为0.18%（n＝8），表明供试品溶液在室温下放置24 h内稳定。

重复性试验：取同一批样品6份，同法制成供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积。结果的RSD为0.02%（n＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：分别量取低、中、高质量浓度的门冬胰岛素对照品溶液各适量，共9份，按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算加样回收率。结果见表1。