基于基因芯片技术探究柴朴汤对哮喘大鼠差异表达基因的调控

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南华大学附属第一医院,1.呼吸内科, 2.中医科, 湖南 衡阳 421000)

支气管哮喘(Bronchial Asthma)是由多种原因共同作用引起的常见病，主要受到遗传因素和环境因素的共同影响，一直是呼吸道疾病研究的热点，但其发生发展的生物学机制及调节机制仍未明确[1]。传统中药治疗哮喘有多种方法，其作用温和且副作用少，不仅可控制哮喘的急性发作，对于患者的远期愈后也具有十分重大的意义。柴朴汤作为治疗哮喘的常用方剂，其疗效已经得到临床验证，但其控制哮喘发作的机制尚不明确。基于此，本研究以哮喘大鼠为实验对象，采用基因芯片技术，在基因水平探究柴朴汤控制哮喘大鼠急性发作及后期修复的作用机制，为柴朴汤的临床用药，提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康SPF级SD大鼠18只，雄性，体重(200±20)g，南华大学动物实验部提供。

1.1.2 药物和试剂 卵蛋白(OVA)购自美国Sigma公司(Ⅱ级)；中药配方颗粒购自广东一方制药有限公司；Trizol、琼脂糖、EB、TBE购自Invitrogen公司；dNTP、RNase Inhibitor、M-MLV 购自Takara公司；RNA提取试剂盒购自东盛生物技术股份有限公司;PCR引物购自江苏联川生物技术有限公司；Phalanx Rat OneArray基因芯片购自台湾华联生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 实验分组及造模 18只健康SD大鼠适应性喂养2周后，按随机数字表法分3组，即正常组、哮喘组及柴朴汤干预哮喘组，每组6只。哮喘造模于第1天与第8天，腹腔注射1 mg卵蛋白加100 mg氢氧化铝配成1 mL生理盐水混悬液，第15天开始，以1%卵蛋白雾化吸入，隔天1次，连续7次，每次持续30分钟。柴朴汤干预哮喘组每次雾化前半小时予以柴朴汤2 mL灌胃；哮喘组予以生理盐水2 mL灌胃；正常组给予生理盐水1 mL致敏、雾化，2 mL生理盐水灌胃作为对照。

1.2.2 肺泡灌洗液炎症相关细胞计数 取左侧肺组织行嗜酸性粒细胞(Eosinophils，EOS)和白细胞(White blood cell, WBC)计数，以生理盐水行肺泡灌洗，收集灌洗液离心(2000 r/min离心20min)，回收细胞，油镜下计数瑞士染色后细胞的数量。

1.2.3 HE染色 造模成功后，采用腹主动脉放血法处死大鼠，取大鼠肺组织，以10%的甲醛溶液固定，行HE染色，光镜下分析肺组织的病理变化。

1.2.4 基因芯片试验及分析 肺组织RNA提取后，基因表达分析使用 Phalanx Rat One Array 基因芯片，用激光共聚焦扫描仪对杂交后的芯片进行扫描，同时扣除背景杂交信号值，每组样品均需行重复实验。

1.2.5 荧光定量PCR检测 使用Real-Time PCR检测肺组织MAL及TPD52的表达，待反应结束后收集所有反应体系中目的基因的初始表达量。将每组目的基因的CT值，与标准曲线对应的CT值对照，得到MAI基因及TPD52L基因的相对表达量。

2 结 果

2.1 柴朴汤对肺泡灌洗液中EOS及WBC数量的影响

与正常组对照，哮喘组中EOS及WBC的数目增多; 与哮喘组对比，柴朴汤干预组中上述炎性细胞数目均显著降低(见表1)。

表1 各组BALF中嗜酸性粒细胞及白细胞数量

2.2 柴朴汤对哮喘大鼠肺组织病理改变的影响

肺组织HE染色后可见：正常组肺泡壁结构完整，管壁无增厚，管腔未见狭窄，周围仅少量炎性细胞浸润；哮喘组可见管壁增厚明显，管腔狭窄，可见大量炎性细胞浸润；柴朴汤干预后，管壁增厚不如哮喘组明显，炎性细胞的浸润也明显下降(见图1)。

2.3 基因芯片杂交结果

芯片扫描后显示显示信号强度均匀，基因点清晰。一个基因的表达由一个荧光亮点表示，亮度越高、数量越多，代表表达量越高(见图2)。

图1 柴朴汤对哮喘大鼠肺组织的影响

图2 基因芯片扫描图

2.4 荧光定量PCR分析结果

哮喘组MAL基因的表达显著低于正常组，在柴朴汤干预后，可见其出现上调；在哮喘组中TPD52L基因表达较正常组显著升高，柴朴汤干预后，其表达发生下调(见表2)。

表2 各组差异表达基因的荧光定量PCR结果与基因芯片结果对比

3 讨 论

本课题组前期通过基因芯片技术，筛选出与哮喘致病密切相关的MAL及TDP52L1基因，从整体分子学水平研究哮喘发病的病因及可能的病理生理机制[2]。

MAL为T-淋巴细胞相关蛋白，是一种主要表达于细胞表面的顶端膜蛋白，可参与上皮细胞的分泌与吸收[3]。同时，也有研究发现Mal可作为囊泡形成与运输相关蛋白，调节顶端膜物质的转运和分泌，通过维持上皮细胞极性，调节多种疾病的发病过程，其分布状态的改变及表达量的下调，可影响正常细胞极性，介导细胞的炎症反应[4-5]。本课题组在在前期哮喘大鼠模型中也发现，随着哮喘炎症反应的进展，MAL基因呈明显的下调趋势。TPD52L1是癌蛋白52(D52)家族成员之一。TPD52L1的基因扩增与病毒转染的细胞增殖及肿瘤细胞的增生都密切相关[6]。Proux V证实逆转录病毒转导的TPD52L1能够促使鸡的神经胶质上皮细胞增生, 又证实了D52家族基因表达介导细胞的增生[7-8]，结合前期基因芯片技术发现TPD52L1在肺组织中的表达随着哮喘病程的进展逐渐上调，据此推测TPD52L1通过参与上皮细胞的增生，影响哮喘疾病的进展。

气道炎症及气道重塑是组成哮喘病理变化的两大基石，但目前其治疗仍是以抑制炎症的糖皮质激素为主，这对改善患者的气道重塑效果差且副作用多，所以急需寻找一种既无明显副作用又可以长期应用，同时拥有良好平喘作用的药物。柴朴汤是针对哮喘病理机制而设的方剂，该方可显著的抑制疾病变态反应并有镇咳、镇静、解痉、抗炎、祛痰、和增强非特异性抗感染免疫功能的作用[9-10]。作为治疗哮喘的常用方剂，柴朴汤治疗哮喘的临床疗效已经得到充分证实[11]。本研究通过基因芯片及实时定量PCR结果分析，发现柴朴汤可上调MAL基因及抑制TPD52L1基因在肺组织中的表达，减轻哮喘气道炎症及重塑的程度，结合本实验结果及相关文献，笔者推测柴朴汤可能通过影响MAL及TPD52L1在肺组织气道上皮细胞中的表达，维持气道上皮组织功能，阻断上皮组织细胞增殖，进而抑制哮喘气道炎症及重塑的进程。