生殖细胞基因编辑与基因治疗的问题与展望——以CCR5基因为例

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(1.苏州大学附属第二医院，江苏 苏州 215004；2.人和未来生物科技有限公司，湖南 长沙 410000；3.湖南郴州第一人民医院南华大学医学转化研究所，湖南 郴州 423000；4.湖南中医药大学，湖南 长沙 410000)

医学科学研究和医学临床实践，需要遵守人类的国际准则和国家的具体法规[1-3]。最近报道的基因编辑婴儿，是一起破坏人类医学伦理底线的非法行医事件的结果。本文仅拟对基因编辑婴儿的基因型与HIV感染关系进行分析，并探讨目前基于基因编辑或基因治疗受精卵的技术局限性和未来需要发展的技术路径。

1 体细胞基因治疗与生殖细胞基因治疗的目前界线

基因编辑技术已广泛用于除人之外的多物种的基因组的改造，为人类的生活带来了革命性的影响，促进人类更健康更长寿的生活[4-5]。然而，由于脱靶效率太高和靶效率也无法保证等多方面的技术不足，基因编辑技术直接应用到改造人类自身属于既没有安全保障也没有伦理法规的许可。学术界和人类社会的共识是，通过多种法律和条文明文禁止在目前利用基因编辑技术对计划出生的胚胎进行基因改造。人类利用基因编辑技术防治疾病的梦想和努力，迄今仍集中在对14天以内的胚胎的科学研究，而不开放任何临床实践。这些可贵的科学研究成果，将回答不同基因位点被编辑的难易程度，不同基因编辑技术的靶效应与脱靶效应的相对比值，和一系列有关效率与副作用的问题，为未来人类能够对自身基因进行修复和改造提供技术和知识储备[6-8]。

科学技术是中性的，科学技术可以转化为商业利益，基因编辑相关的基因治疗未来也有可能用于针对部分遗传缺陷的早期胚胎的纠正，但底线是为了人类的健康。在目前，基因治疗的临床实践可以在体细胞层面开展，而对于生殖细胞则严格局限于14天以内的胚胎的科学研究，这是学术界和管理层所认知的体细胞基因治疗与生殖细胞基因治疗的目前界线。

2 基因编辑婴儿基因型与HIV感染关系分析

2005年，我们在《CCR5与艾滋病的防治》一文中第一次指出，“就艾滋病患者而言，在治疗上，可将其视为再生障碍性贫血或白血病患者看待，通过移植对HIV具有一定抗性的CCR5-Δ32基因型骨髓，达到重建其免疫力的目的。虽然骨髓移植本身对患者体内的HIV病毒并无直接抑制或杀灭作用，但新建立的白细胞系由于其CCR5突变而导致HIV的入胞过程受阻，将有可能使其从艾滋病患者逆向转化为HIV携带者。上述异体骨髓移植存在两大弱点，即器官移植的排斥反应和CCR5-Δ32基因型骨髓来源的匮乏。虽然欧洲人种中CCR5突变型纯合子可高达1%，但因其它疾病、年龄、及捐献意愿等因素，实际可用的骨髓仍十分有限。与此相反，自体骨髓移植则可克服上述缺陷。因此，就HIV感染者而言，通过对其自身造血干细胞进行CCR5体外致突变，可在更大范围内受益于HIV患者”[9]。HIV病毒根据其进入白细胞的受体通道，分为R5噬型，X4噬型和混合型。CCR5蛋白是HIV-1中R5噬型进入白细胞的受体，因此，无论是天然发生的突变导致该蛋白功能丧失，还是人工基因工程改造使其失活，都可能具有阻止相关病毒进入白细胞的能力，这是我们2005年提出上述两种基因干预方案用于治疗艾滋病的生物学基础。需要强调的是，这两个方案有明确的适应范围，那就是相关R5噬型的HIV感染者或艾滋病患者[10-11]。

医学知识对预防和治疗在拟达到的目的和需要采取的措施上有所不同：但凡预防，总希望能尽可能杜绝某种疾病的发生，一般所指对象是疾病；而治疗，则是针对患病个体。这种预防与治疗的差别，决定了CCR5可以有效合理成为治疗艾滋病的靶标，而不适宜或不应当作为预防尤其是基因工程手段用于预防HIV感染的靶标[12-13]。除从人群的角度分析之外，就本次基因编辑的双胞胎，其感染HIV的机会不大，而基因编辑带来的脱靶效应是难以预知的和肯定的，即使对所选择靶点达到预期的基因编辑效果，仍然不能提供对HIV的全面抵抗力，所以该临床实践与医学伦理完全相悖，同样也缺乏技术与科学基础。

表一罗列了CCR5基因型与表型的可能关系。X4噬型的HIV感染与CCR5没有密切关系，当CCR5蛋白因该基因的双拷贝突变导致功能完全丧失时，相关个体则对R5噬型可以产生抵抗力或免疫力。这一点已为多项流行病学数据所支持，同时临床实践也通过柏林病人获得了证明。目前大量开展的造血干细胞体外基因改造基因治疗临床研究，也是基于这一原理。

然而, 在最近报道的基因编辑婴儿事件中，我们结合已公开的突变信息与已知的胚胎DNA含量分布数据分析认为该双胞胎婴儿均是镶嵌体，其中Lulu的CCR5基因型多态性以CCR5 +/-15为主，不能提供对HIV的抗性；而Nana的CCR5基因型多态性相对更为复杂多样，以CCR5 -4/+1/+为主。尚无足够的数据用以分析体细胞基因型。基因编辑用于基因改造的两种主要方式是同源重组和非同源末端连接，前者可以对基因进行敲进，敲出，制造特定突变；后者主要用于功能性敲除。基因的功能性敲除的充要条件是：(1)得到移码突变；(2)并且要求是所有细胞靶点基因的双拷贝的移码突变；(3)突变基因转录的mRNA不能产生有功能的蛋白分子。

表一列出的信息显示，镶嵌体女婴Nana的细胞构成无法满足上述充分必要条件的第二点。虽然大部分细胞所带有的基因型可能满足第一点，但第三点目前仍无法确认。一般情形下，移码突变在突变处随后会很快形成终止密码子突变，终止密码子通过在RNA和蛋白质两个水平发挥作用，使基因功能失活。在RNA水平，非天然终止子通过启动无义突变介导的mRNA降解，达到阻止蛋白质的翻译过程。在蛋白质翻译过程中，终止子通过终止翻译过程，在中心法则通道的最后环节防止错误信使核糖核酸信息向蛋白质转递。就CCR5基因而言，是否任意可以移码突变都可有效失活CCR5蛋白功能，如Nana通过基因编辑形成的四个碱基的缺失和一个碱基的插入，则不可简单从基因型推测表型。

从人群层面看，对HIV具有最大抗性的CCR5突变为32碱基缺失型，该突变推测为800年前左右发生的一次偶发突变，目前携带这一突变的人口数量超过一亿人。根据小插入和小缺失的突变规律[14-15]，当一个32碱基缺失发生时，一个碱基缺失的机率则要达一千倍以上，换言之，即可以出现上千次的随机发生的一个碱基缺失事件，总计一碱基缺失，二碱基缺失，四碱基缺失，和一碱基插入，而碱基插入，随即发生的频次可以在1500～2000之间。CCR5的32碱基缺失突变之所以在现代人群中能快速扩散，一种解释是该突变同时对历史上多次大规模爆发的天花同样可能具有抗性。流行病学研究表明，32碱基缺失的单拷贝个体，即表现出一定的对HIV感染的抵抗力。而相应容易高频发生的那些理论上可以导致阅读框架移动的小缺失和小插入，并没有在现代人群中发现，除了这些突变在历史上没有发生之外，另一种可能的解释是这些突变不能或至少单拷贝突变不能为突变携带者提供有效的对天花的抵抗能力。CCR5蛋白由一个外显子编码，其mRNA上因移码形成的终止子难以启动无义突变介导的mRNA降解，而含有小插入和小缺失的mRNA，可能在随后的翻译过程中通过翻译的通读机制，最后产生具有部分功能或基本正常功能的CCR5蛋白。因此，Nana的-4和+1的小突变，不一定能使CCR5蛋白丧失功能。

表1 基因编辑双胞胎婴儿的遗传特性和抗HIV感染的预期抗性

3 基因编辑脱靶效应的影响

基因编辑没有完全不脱靶的技术，在现有的几种常用基因编辑工程核酸酶中，一般认为TALENs较ZFNs脱靶效应低，而CRISPR-cas9脱靶效应相对较高。但是，在实用性方面，后者则具有极大优势，这是其被广泛用于动植物和微生物基因组改造的主要原因。这次发生的基因编辑婴儿事件所采用的基因编辑技术，采用了CRISPR-cas9系统。在技术层面上，cas9采用长度约为20个碱基的gRNA寻找和结合具有互补碱基关系的DNA双链，然后cas9在结合处形成一个双链断裂切口。理论上，依据设计的与gRNA完全互补的靶点，即可能产生靶效应的基因位点；而与gRNA不完全互补的基因位点，则是潜在的脱靶效应的作用位点。由于CRISPR-cas9系统是微生物进化得到的一套防御体系，从实用的角度出发，这套体系防御效率最大化的一种简单方式是对与gRNA不完全的外来基因也能识别和破坏。大量基因编辑的实验研究表明，CRISPR-cas9对与gRNA不完全互补的基因位点，在一碱基，二碱基甚至更多个碱基不互补的条件下均可形成双链切口，这由该系统生物学特性所决定，是该体系用于人类基因治疗有待克服的一个巨大障碍[16-19]。

对人以外生物物种的基因改造，最关注的是靶效应，脱靶效应可以通过后续的基因交换方式将靶效应与脱靶效应分离开来。然而，对人的基因治疗，由于不可能通过后续的基因交换方式剔除脱靶效应，因此脱靶效应与靶效应的比值，也即药物研发中的安全系数便成为无法回避的问题。由于上述cas9脱靶效应在基因组上的范围和对不同脱靶位点的基因编辑程度均具有极大不确定性，因此这一技术即使是在今天医学伦理已经允许基因编辑胚胎的条件下，也还远远未能用于临床实践的成熟程度；而目前医学伦理严禁人体胚胎基因改造的任何临床实践。

脱靶效应的第一个影响是基因编辑个体的健康。对基因治疗而言，基因治疗的靶点，一般会选用基因型与表型关系明确的靶点。但是，脱靶效应由于其脱靶的不确定性，可能受影响的基因众多，当与系统发育成熟的基因被编辑后，个体的生长发育有可能受到不同程度的影响。这种不利影响尽管通过出生后的全基因组测序可以有所预警作用，但由于基因间相互作用的复杂性，尤其是即使可以预知却不能预防和纠正的负面影响，对基因编辑个体会导致器质性和心理的双重伤害。脱靶效应对生长发育的影响相对较小，因为这需要脱靶效应设计的细胞数量较多才会有所体现。但是，对肿瘤风险而言，则只需要很少数量的细胞中的抑癌基因或原癌基因受到波及，其风险将会难以估量。

脱靶效应的第二个影响是对人类基因池的长期改变。除非接受生殖细胞基因治疗的胚胎发育成人后不孕不育，否则对人类基因池的影响难以完全排除。作为一个物种，人类的基因池在人类生命的进程中保持相对稳定的同时，一直与其他物种的基因组成分具有交流，如现在人类体内含有古尼安特人的基因成分，含有多种病毒类似成分，等等。除编码必须核糖核酸和蛋白质的基因外，人类基因组中大量结构是由假基因，重复片断如Alu序列等功能未知或未完全明了的序列组成。这些占人类基因组绝大比重的功能未知的结构，不排除具有像微生物的CRISPR系统一样可以不停接纳外来序列以增强自身对环境适应的能力。生殖细胞基因治疗的最理想方式是既能治愈遗传缺陷又不在人类基因池留下残余影响。

生殖细胞基因治疗对基因池的影响有两方面基因来源，一方面是用于基因治疗的基因材料，另一方面是基因治疗手段对人类基因组的不可预知的突变也即脱靶效应的后果。这里显然存在一个互相矛盾的取舍。若减少基因治疗材料对基因池的影响，如基因编辑酶均采用蛋白质而不是核酸，这一策略需要在受精卵和早期胚胎内完成基因修复过程，但其可能导致的脱靶效应会相对广泛，也因此，由脱靶效应对基因池的影响相应可能会变得更大更危险。

最后需要特别强调的是，脱靶效应对基因池的影响，最终由脱靶效应在生物功能上属于正向选择还是中性或负向选择有关。除了生物学效应外，社会美学价值，在一定程度上可以使负向选择的生物学效应逆转为生殖繁育上的正向选择，这将会带来灾难性后果[20]。

4 生殖细胞基因治疗的适应范围和需要优化的技术路径

为了避免误导，这一部分的第一句话开宗明义地指出，生殖细胞基因治疗目前只可以对14天以内的胚胎进行科学研究，任何在现阶段计划或实施临床实践的行为，都是不可容忍的。基因治疗技术本身的成熟度和人们对基因治疗的认可度，决定生殖细胞基因治疗可否以及何时可以在伦理上允许临床实践。如果基因治疗不产生脱靶效应也不对人类基因池产生残留影响，基因治疗将有如物理性手术治疗一样不存在伦理挑战，和不存在应用范围受到脱靶效应困扰的多种限制。

在《人类疾病的基因治疗》章节中，我们对基因治疗的范围之广和应用前景，有很乐观的预期，这种乐观预期一定程度上得到了二十年内基因治疗进步的验证。而在上述章节中，我们详细区别了体细胞基因治疗与生殖细胞基因治疗的差别。生殖细胞基因治疗是人类亘古的梦想，最近比较实用的基因编辑技术研究，推动基因治疗从体细胞基因治疗向生殖细胞基因治疗向前迈进了一大步，我们可以更从实际应用层面遥望生殖细胞基因治疗和讨论其适宜的指征等。由于在可预见的短期未来，我们还难以获得基因治疗成熟度高的成熟技术。因此，对生殖细胞基因治疗的适应范围予以限制和对实施途经予以限制，可以减少对个体和对人类群体的不利影响。

4.1 生殖细胞基因治疗的适应范围

生殖细胞基因治疗的适用范围，或者说应用生殖细胞基因治疗的原则，无论是在技术还不成熟的现在，还是在技术更成熟的未来，生殖细胞的基因治疗应局限于单基因遗传病的治疗。这一局限基于以下思考或建议，以及还需要对单基因遗传病有诸多进一步的限制：

(1)局限于基因的治疗，而不是基因性状的优化；(2)局限于遗传病的治疗，而不是感染性疾病的预防，后者应以发展疫苗和药物作为重点；(3)局限于单基因遗传病，而不是多基因遗传病；(4)局限于表型严重且除纠正基因外完全没有其他防治手段的单基因遗传病；(5)

局限于染色体单基因病而不包括线粒体遗传病。

4.2 生殖细胞基因治疗需要优化的技术路径

随着体外生殖技术的进步和显微操作技术的成熟，在不同细胞间转移细胞核或转移线粒体，都已经变成了技术可靠的常规技术。然而，这些操作本身并不涉及对人类基因组的修改，与生殖细胞基因治疗有着天然的区别。因此，上述操作，可以在受精卵层面进行，而不会对被处理的受精卵发育的个体产生类似基因治疗的脱靶效应的有害影响，也不会对人类基因池产生残留外源基因的危害。

未来最小化生殖细胞基因治疗的脱靶效应对接受基因治疗个体和对人类基因池的危害，基因治疗的操作过程可以像上述体外生殖过程一样在受精卵内进行，但是，基因编辑过程，基因修复过程，可以在胚胎发育到一定阶段甚至在婴儿出生后进行。这一建议具有以下诸多特点和优点，可以作为未来生殖细胞基因治疗的备选技术路径：(1)受精卵仅仅作为基因操作工具的储存载体和被整合受体；(2)被整合的基因治疗工具被均等和有效输送至发育后的胚胎或婴儿的全身细胞；(3)基因编辑和基因治疗可以在产前或产后特定生命阶段启动；(4)基因治疗涉及到可能产生新抗原性蛋白的情形，则宜在胚层形成后尽早进行；(5)基因编辑和基因治疗可以在特定的一种或为数不多的几种细胞类型进行，细胞类型特异性启动子参与这一调控；(6)基因编辑和基因治疗的启动有外源性化学小分子或光热等物理条件调控；(7)基因操作工具可以自带从基因组中剔除基因操作工具本身的自清理体系。

5 小结与展望

生殖细胞的基因治疗，是人类用自我认识世界的力量对人类自身进行纠错的千年梦想。随着基因编辑技术的出现和可实用化，尤其是在多种动植物和微生物物种基因组改造中的成功应用，人类离生殖细胞的基因治疗仅有一门之隔了。打开这扇门，需要技术的进一步成熟，和伦理的相应更新，而技术和伦理是互相依存的，在期待生殖细胞基因治疗早日惠及人类医疗保健事业过程中，希望有关基因编辑婴儿的基因与基因组相关分析，能从学术层面上，通过基因治疗的靶效应与脱靶效应的讨论，能把体细胞基因治疗和生殖细胞基因治疗清晰的区分开来，促进基因治疗的健康发展[21-22]。