RIP1在肝癌组织中的表达意义及其对细胞侵袭、迁移的影响

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肝癌是当前常见的肝脏恶性肿瘤，主要分为原发性和继发性两类，恶性程度极高，发现较晚，对患者生命健康造成严重威胁[1]。目前针对肝癌治疗的方法主要包括手术治疗、化学药物治疗、放射治疗以及生物治疗等，但由于该病易出现复发和远处转移，肝癌患者的预后仍不理想[2]。受体相互作用蛋白激酶1(RIP1)是RIP家族最新成员，是一组具有同源激酶结构域但功能域不同的相似蛋白亚型[3]。研究发现，RIP1蛋白质，参与细胞凋亡，控制炎症反应，影响细胞周期及维持组织或生物体的稳态[4]。Lin[5]指出，RIP1与非小细胞性肺癌的形成以及癌细胞侵袭过程有关。同时也有研究指出抑制RIP1的表达能够促进大肠癌细胞的凋亡[6]。以上研究结果均在一定程度上提示RIP1具有促癌基因的效应，但RIP1与肝癌的关系尚不明确。因此，本研究结合组织病理染色及基因抑制实验进行相关研究，通过体外抑制该基因的表达，并观测RIP1基因被抑制后对肝癌细胞侵袭、迁移能力的影响。

1 资料与方法

1.1 免疫组织化学染色与分析

收集48例肝癌组织及其对应癌旁组织并制作成石蜡切片，组织均来自于病理科，相关研究符合伦理学标准。取材及病理:肝癌标本按照肿瘤的实际侵犯位置取材，每个瘤块取三个不同方位，在距离肿瘤取材周围2 cm处留取癌旁组织，然后将肝癌及癌旁取材标本放入4%多聚甲醛溶液中固定,石蜡包埋,制成蜡块。免疫组化方法:石蜡切片脱蜡和水化,修复抗原,滴加封闭液。加滴RIP1一抗液，4 ℃过夜。再滴加二抗，DAB显色,苏木素复染，中性树胶封固。每次实验均做阳性与阴性对照,阳性细胞桨着色为棕黄色，每例均设有HE切片作对照观察。免疫组化结果判断标准：采用双盲法观察切片，RIP1免疫组化在细胞膜上染黄色或褐色。实验样本根据细胞染色强度和细胞染色比例独立评分。根据被染色细胞在细胞总数中所占的比例进行评分，阳性细胞<5%记0分，5%～25%记1分，26%～50%记2分，51%～75%记3分，76%～100%记4分。该细胞染色的强度由颜色程度来确定，即无、弱、中、强评分分别为0、1、2和3分。每个病人综合得分为0～7分，将RIP1low组的分数定为≤3分，RIP1high组得分>3分[5]。

1.2 仪器

人肝癌细胞株Hep3B、SMMC-7721、Huh-7购于中科院昆明细胞库；PLC/PRF/5、HepG2、HCCLM3购于中国科学院上海细胞库；Trizol试剂和慢病毒转染试剂polybrene购于上海翊圣生物科技有限公司；RNA提取试剂盒和逆转录试剂盒购于大连宝生物工程有限公司；目的基因shRNA-1序列:5′-CACCGGAGGTGAATGAGGACTATAACGAATTATAGTCCTC ATTCACCTCCTTTTT-3′，shRNA-2序列:5′-CACCGTATATCAAACTGACAGAATCCGAAGATTCTGTCAG TTTGATATACTTTTT-3′。RIP1兔抗单克隆抗体，购自美国Abcam公司;ECL成像系统，由Bio-Rad Laboratories科技公司提供；Transwell小室购自于美国Corning公司。

1.3 肝癌细胞培养、筛选及沉默

Hep3B，SMMC-7721细胞使用RPMI-1640培养基10% FBS培养，HCCLM3、HepG2细胞用DMEM高糖培养基，10% FBS培养，以上细胞均置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养。待以上各细胞处于融合达70%～80%时，收取细胞蛋白，使用WB法，筛选出高表达RIP1的细胞株。将该细胞株使用上述方法，行慢病毒转染。将所培养的细胞随机分为三组：对照组、shRNA-1抑制组、shRNA-2抑制组。待各组细胞融合率达70%～80%时，经行转染操作。其中，shRNA-1组、shRNA-2组分别转染对应的RIP1慢病毒抑制基因序列，对照组加转染试剂但不予干扰序列。使用并收集转染72 h时的各肝癌细胞经行后续实验。本研究RNA干扰设计图见图1。

图1 RNA干扰设计图

1.4 慢病毒载体沉默RIP1表达

采用WB法及RT-PCR法检测。取各组转染72 h细胞，提取蛋白，并进行定量测定。按照每孔约30 μg，按110 V恒压电泳，220 mA恒流条件转膜，转膜时间约100 min。然后脱脂牛奶封闭1 h备用，再孵育RIP1抗体及内参，4 ℃条件下孵育过夜，第二日滴加二抗，室温孵育1 h，曝光条带并分析结果。经过实验，挑选出HCCLM3肝癌细胞进行下一步实验，RT-PCR法结果也验证了该结论。

1.5 细胞侵袭及迁移能力测定

采用Transwell细胞侵袭试验和细胞划痕试验测定细胞相关运动能力。细胞侵袭试验，Transwell小室放置于预先制备好Matrigel基质胶的24孔板中，按上述条件在培养箱中过夜，向Transwell小室下室中加入500 μL含10% FBS的DMEM高糖培养基。用无血清的DMEM高糖培养液重悬各组细胞，取100 μL细胞悬液(细胞总数约1×105个)加至Transwell的上室。48 h后将小室置于4%的多聚甲醛中固定15 min，擦去小室内室膜上的细胞，结晶紫溶液(0.1%)染色10 min后显微镜下观察，每孔随机选取5个视野拍照，统计并分析。细胞划痕试验，在6孔板中培养前述肝癌细胞，将细胞在无血清中持续饥饿24 h后使用移液枪头进行划伤，再用PBS洗涤，在0，24和48 h时使用相差显微镜进行拍照。随后通过手动计数进行细胞抑制率的测定，相关结果用百分比表示，上述所有实验均常规进行三次。

1.6 统计方法

采用SPSS19.0统计软件进行分析处理。多组比较采用单因素方差分析，两组间比较采用成组t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 免疫组化染色及病理分析

48例肝癌患者中，22例被染色，染色阳性率为45.83%，其中，强阳性患者为15例，中等及弱阳性7例，同时，有6例复发患者。观察免疫组化染色结果，可见RIP1主要在细胞核中表达，RIP1在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织且在复发患者中的表达显著高于未复发患者(均P<0.05)(图2、图3)。RIP1的阳性表达与患者的总生存率密切相关(OR=0.560，95%CI:0.383～0.818，P=0.003)且与无复发生存率(OR=0.540，95%CI:0.369～0.791，P=0.002)密切相关。

图2 肝癌患者中的RIP1表达情况

图3 复发和未复发肝癌组织中RIP1蛋白表达情况定量图

图4 不同肝癌细胞系中的RIP1表达情况

2.2 肝癌细胞系RIP1表达筛选

对各肝癌细胞系RIP1蛋白表达进行检测，可见4个细胞株中，HCCLM3的RIP1蛋白相对表达量最高，可以用于后续实验(图4)。

2.3 肝癌细胞HCCLM3的RIP1抑制

观察慢病毒载体抑制HCCLM3的RIP1的表达情况，可见shRNA-1组、shRNA-2组RIP1表达明显被抑制，且shRNA-2组抑制效果更为明显(均P<0.05，图5)。

图5 肝癌细胞HCCLM3慢病毒载体抑制

2.4 肝癌细胞HCCLM3的RIP1抑制后侵袭能力改变

与对照组相比较，shRNA-2组可明显抑制HCCLM3的细胞侵袭能力(P<0.01，图6)。

图6 肝癌细胞HCCLM3慢病毒载体抑制后的各组

2.5 肝癌细胞HCCLM3的RIP1抑制后迁移能力改变

与对照组相比较，shRNA-2组可明显抑制HCCLM3的细胞迁移能力(P<0.05，图7)。

图7 慢病毒载体抑制肝癌细胞HCCLM3中RIP1

3 讨 论

在以往的研究中，多数学者认为RIP1有助于肿瘤的抑制，因为该基因可以参与各种细胞应激，从而诱导细胞凋亡和程序性坏死[7]。如Qiu等[8]发现RIP1参与卵巢癌细胞CD40配体所驱动的坏死细胞样细胞凋亡。在关于骨肉瘤的研究中，Fu等[9]也指出，紫草素正是通过激活RIP1和RIP3来发挥对骨肉瘤细胞的抑制作用。然而近期的研究却发现，RIP1在肿瘤发病机制中可能有不同的生物学功能。部分学者在检查了胃癌和正常胃组织中RIP1的表达情况后发现，与正常胃组织相比，RIP1在胃癌组织中表达显著增强并且其表达程度与胃癌患者预后密切相关[10]。同时研究也发现，RIP1在黑色素瘤中也呈高表达，并通过调节NF-κB信号通路进而加速黑色素瘤细胞的生长[11]。基于以上研究，本研究设计了RIP1与肝癌细胞的实验，并探讨其表达程度与肝癌之间的关系。

首先本研究通过免疫组化实验证实，48例肝癌患者22例均表现为RIP1阳性表达，阳性染色率为45.83%。同时，RIP1阳性表达程度与患者术后生存率以及无复发生存率密切相关，RIP1表达越高，患者术后生存时间越短且复发可能性越大。这也进一步证实了RIP1可能与肝癌患者的发病和预后存在关联。之后本研究通过筛选出RIP1表达量最高的肝癌细胞系，HCCLM3中RIP1表达量最高并被应用于后续实验。另外为了实验的稳定性特选择了两条RNA抑制序列且shRNA-2抑制效果更明显。肿瘤的侵袭和迁移指的是肿瘤细胞脱离原发部位向其他部位发生远处转移，并形成继发性的新的肿瘤过程[12]。侵袭和迁移是目前恶性肿瘤最主要的特征也是引起患者死亡的重要原因[13]。随着分子生物学以及基因靶向治疗研究的不断发展，越来越多的基因和细胞分子被证实在癌细胞的侵袭和转移中起着不同的调控作用[14]。有研究证实抑制RIP1的表达能够抑制皮肤黑色素瘤细胞的增殖[15]。Pietkiewicz等[16]在关于胰腺癌的研究中发现，沉默RIP1的表达可促进胰腺癌细胞的凋亡，对于胰腺癌具有保护作用。为探究RIP1与肝癌细胞生物学特性的影响，本研究设计了Transwell细胞侵袭试验和细胞划痕试验，结果证实，抑制肝癌细胞中RIP1的表达后，肝癌细胞的侵袭和迁移也被显著抑制。这也进一步证实了RIP1抑制对于肝癌细胞侵袭和迁移的保护作用。然而对于RIP1抑制肝癌细胞侵袭和迁移的具体机制尚未完全明确，今后仍然需要进一步从分子作用以及信号通路等层面进行后续研究。

综上所述，RIP1在肝癌中存在高表达，可能参与了肝癌细胞的侵袭和迁移过程。慢病毒载体抑制HCCLM3肝癌细胞中RIP1的表达可抑制肝癌细胞侵袭及迁移能力，RIP1可能会发展并成为HCC患者预后不良的新型生物标志物以及今后肝癌治疗的潜在靶点。