长链非编码RNA在弥漫大B细胞淋巴瘤中的研究进展

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(南华大学衡阳医学院肿瘤研究所；肿瘤细胞与分子病理学湖南省重点实验室，湖南 衡阳 421001)

1 LncRNA

LncRNA是一类长度>200个核苷酸的RNA分子，最初在2002年由冈崎等人在小鼠中通过大规模测序发现并首次报道。由于lncRNA没有明确的开放阅读框架，它不参与或很少编码蛋白质，使其在发现时就被认为是基因转录的“噪音”。LncRNA经历剪接，聚腺苷酸化和5′加帽，从而与mRNA具有相似的结构，但lncRNA显示出与mRNA明显不同的特征，即lncRNA具有较少数量的外显子和较高的组织特异性[1]。根据LncRNA在基因组的位置可以分为：(1)反义lncRNA；(2)内含子非编码RNA；(3)基因区间的lncRNA；(4)启动子相关lncRNA；(5)非翻译区lncRNA。LncRNA可与DNA，RNA和蛋白质其中一种或多种相互作用，可大致分为：(1)lncRNA通过海绵吸附miRNA，从而调控靶基因表达；(2)lncRNA与蛋白质结合，调控蛋白质功能；(3)作为结构组分，与蛋白质形成核酸蛋白质复合物，例如lncRNA与蛋白质复合物，可结合到基因启动子区域并调控基因的转录；(4)干扰邻近蛋白编码基因的表达；(5)抑制RNA 聚合酶Ⅱ，或介导染色质重构和组蛋白修饰，从而影响基因表达；(6)lncRNA可与基因的转录本形成互补双链，并在Dicer酶作用下生成内源性的小干扰RNA(Small interfering RNA ；siRNA)，以调控基因的表达水平；(7)结合在特定蛋白上从而改变该蛋白的胞质定位[2]。近年来，随着lncRNA成为研究热点，已经发现一些异常表达的lncRNA在各种癌症中扮演着重要的角色，如肝细胞癌(LncRNA-HEIH)，乳腺癌(lncRNA-HOTAIR)，前列腺癌(PlncRNA-1)和非小细胞肺癌(LncRNA-MALAT1)，已经证实这些lncRNA参与肿瘤的进程并且有望成为肿瘤标志物。而lncRNA在DLBCL中的作用也不断被报道。

2 LncRNA与DLBCL发病机制的关系

2017年世界卫生组织预估美国2018年淋巴瘤的新发病人数及死亡人数中，NHL占比90%以上，而DLBCL是来源于B细胞的NHL，是成人NHL中最常见的类型，占所有NHL的35%～40%，占全球侵袭性淋巴瘤的80%以上[3]。根据DLBCL发生的细胞来源，可以将其分为二种亚型：(1)生发中心B细胞样(GCB)DLBCL；(2)活化B细胞样(ABC)DLBCL。大量研究表明lncRNA是DLBCL基因调控网络的重要组成部分，88%的新型lncRNA的表达至少与一种蛋白质编码基因相关[4]。DLBCL是一种极其复杂性的侵袭性疾病，由于在临床表现、mRNA表达和基因突变等方面具有高度异质性的原因，Verma等[5]人通过对116例DLBCL组织和30例DLBCL细胞系的RNA测序(RNA-seq)数据进行分析，发现2 632个具有差异性的lncRNA，其中大约一半仅在DLBCL组织或细胞系中表达，且小部分病例中发现肿瘤特异性lncRNA；而这些差异lncRNA中有465个新型lncRNA可以用来区分ABC和GCB 型DLBCL。Zhou等[6]通过收集GEO数据库中ABC-DLBCL及GCB-DLBCL的测序数据，发现156个具有特异性的差异lncRNA，与Verma等[5]人所发现的lncRNA没有任何重叠，再次证明DLBCL的高度分子异质性，他们在这156个亚型特异性lncRNA中发现有17个lncRNA可以区分ABC和GCB型DLBCL，并称其为subsigLnc-17，其特异性和敏感性约为90%。除了对DLBCL的上述亚型的分类研究以外，另一些基于此分类的研究报道DLBCL基因突变表达谱的文献比比皆是，旨在寻找DLBCL发生发展的初始动力。GCB-DLBCL大约30%～40%存在t(14;18)易位，30%存在c-rel扩增，20%存在组蛋白甲基转移酶EZH2的突变，并且10%存在PTEN的缺失；相反ABC-DLBCL的特征在于NF-κB信号通路的活化，从而促进细胞的存活及增殖，抑制细胞凋亡，因此更具侵袭性及较差的临床预后；而抗凋亡蛋白B淋巴细胞瘤-2(BCL2)在GCB-DLBCL与ABC-DLBCL中均过表达[7- 8]。为了进一步明确lncRNA与DLBCL初始动力之间的关系，Verma等[5]人筛选出位于基因反复扩增区域并且同时过表达lncRNA，更深入地探讨其与转录抑制因子BCL6和EZH2之间的共表达模式，发现323个和431个lncRNA分别与BCL6和EZH2的表达呈负相关，其中>40%的lncRNA是由EZH2或BCL6诱导的，认为其中一些lncRNA可能是BCL6或EZH2的靶基因。以上研究表明lncRNA是DLBCL发生的初始动力中至关重要的一部分，在DLBCL的发病机制中起潜在作用。Peng等[9]研究发现lncRNA LUNAR1在DLBCL细胞系与组织中过表达，通过qRT-PCR和Western blot等实验观察到在沉默LUNAR1的表达后，转录因子E2F1和细胞周期蛋白D1(cyclin D1)表达下调(E2F1在多种癌症中呈现过表达模式，其高水平促进癌症进程；cyclin D1是调节细胞周期的重要蛋白之一，在许多癌症中过表达，通过结合并激活CDK4 / 6，进而磷酸化肿瘤抑制蛋白(Rb)，使细胞由G1期进入S期)；相反p21的表达增加(p21在多种癌症中表达不足或缺失)，从而抑制细胞增殖，此项研究表明E2F1，cyclin D1和p21可能是LUNAR1的功能靶点。与此同时，他们还发现lncRNA HULC和lncRNA PEG10在DLBCL细胞中过表达，而基因间lncRNA- p21(lincRNA-p21)在DLBCL组中低表达，功能试验发现HULC亦可通过cyclin D1和BCL2影响DLBCL细胞的增殖与凋亡，而PEG10的过表达与治疗效果及预后呈负相关；在上调lincRNA-p21的表达后，明显抑制DLBCL细胞的增殖，且与B症状(持续三天体温>38 ℃，盗汗或者6个月内不明原因的体重下降>10%)、国际预后指数(IPI)评分显著相关[10-12]。他们指出lncRNA LUNAR1、HULC、PEG10及lincRNA-p21有望成为DLBCL的肿瘤标志物。

3 LncRNA与DLBCL的耐药性

在治疗上，阿霉素是DLBCL的有效药物之一，当癌细胞暴露于阿霉素时，可以诱导癌细胞上皮-间质转化(EMT)，刺激细胞形态变化和耐药性，进一步增强侵袭能力。蛋白LC3及p62是检测自噬的常用标志物，而p62的表达水平与自噬呈负相关，而自噬的激活可以抑制EMT的发生[13]。Li及其同事发现LncRNA MALAT-1在DLBCL细胞系中过表达，下调MALAT-1能抑制DLBCL细胞的增殖和迁移侵袭，使细胞在G0/G1期阻滞；为了进一步探讨MALAT-1在DLBCL化学敏感性中的作用，观察到在下调MALAT-1后LC3-II/LC3-I蛋白表达升高，p62蛋白表达降低，表明下调MALAT-1后可激活自噬，抑制阿霉素诱导的EMT，从而降低对阿霉素的耐药性，类似的结果在裸鼠体内也得到证实[14]，为后续DLBCL避免耐药的相关研究提供新方向。

4 LncRNA与DLBCL的预后

IPI是以临床特征为基础，包括年龄(>60岁为1分)、乳酸脱氢酶水平(LDH，>正常为1分)、美国东部肿瘤协作组ECOG的体能状况评分(2/3/4级为1分)、Ann-Arbor分期(III/IV为1分)、淋巴结外病变受侵数目或侵犯重要脏器(≥2个部位为1分)，上述五项IPI指标评分总和：0～1分划分为低危组，2分划分为中低危组，3分划分为中高危组，4～5分划分为高危组，它是鉴别DLBCL高危患者和个体化治疗的最有力指标[8]。然而，IPI并没有考虑DLBCL患者的分子异质性因素，即使IPI变量相同或相似的患者，他们的生存预后间差异有显著性。Yan等[15]发现DLBCL组织与细胞系中的lncRNA HOTAIR过表达，且HOTAIR的表达水平与较高的IPI评分相关， HOTAIR的表达下调能使细胞停滞在G2/M期，促进细胞凋亡，抑制细胞增殖，建议HOTAIR可用作预后指标。另一项研究通过提取GEO数据库中微阵列数据集，分析了1 043名DLBCL患者的lncRNA表达谱，从高危组和低危组患者中发现6个lncRNA(SACS-AS1，MME-AS1，CSMD2-AS1，RP11-360F5.1，RP11-25K19.1，CTC-467M3.1)存在显著差异，并将这6个lncRNA组合到基于6-lncRNA的形式命名，通过使用单变量Cox回归分析发现6-lncRNA与DLBCL患者的总生存(OS)显著相关，且6-lncRNA可以预测与IPI变化相同或相近患者的生存情况，提示6-lncRNA有望成为辅助IPI在分子水平上的预后指标[16]。由于DLBCL患者采用目前的标准治疗利妥昔单抗-环磷酰胺-阿霉素-长春新碱-泼尼松龙免疫化疗方案(R-CHOP)，CHOP治疗或针对基因突变的靶向治疗，其中50%的患者出现耐药，甚至疾病复发，约三分之一的患者最终死于疾病，而上述研究报道的这些lncRNA可以为深入研究DLBCL的发病分子机制提供新思路，同时为DLBCL诊断、治疗及预后提供新的方向。见表1。

表1 LncRNA在DLBCL中的研究总览

5 展 望

自2011年第一次报道了全基因组lncRNA表达谱以来，目前基因注释在人类基因组中存在15 000至60 000个lncRNA，大约70%的lncRNA在物种间保守性很差，这就要求研究时要使用原代细胞，人源化动物或灵长类动物模型，有助于更深入的了解其在体内功能及其与其他分子之间的相互作用。而GWAS的研究揭示了染色体区域内被称为“基因沙漠”的SNPs，可能与lncRNA的功能有关，最近研究显示26%疾病相关的SNPs(n=11,194)与lncRNA相关联的，而最明显的淋巴瘤相关SNP位于8q24的PVT1基因座上[17]。同时，大量证据表明lncRNA参与淋巴瘤的形成及淋巴瘤细胞的生物学行为。它们在细胞中的高度特异性表达模式使它们有望成为潜在的新型肿瘤标志物。

在过去的十年中，研究lncRNA的技术取得了很大的进展。如采用CRISPR-Cas9或反义寡核苷酸(ASO)技术来实现共转染敲低，应优于常规RNAi方法；可以使用常规蛋白质-免疫沉淀(IP)或新颖的lncRNA-IP技术，如RNA纯化染色质分离技术-CHIRP来研究LncRNA与蛋白质之间的相互作用。最后，RNA-荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)技术已经开发出来可视化活细胞中的单个lncRNA分子[18]。此外，lncRNA数据库不断增长，通过评估lncRNA与已知蛋白质的共表达网络来确保lncRNA整合到系统生物学中。总之，lncRNA作为DLBCL发生发展的主要参与者正在被迅速挖掘。一些lncRNA显示出作为治疗靶标的潜力，特别是那些积极参与化疗效果介导的靶分子，努力开发可以特异性破坏lncRNA与蛋白质相互作用的小分子抑制剂。随着基于反义寡核苷酸的疗法逐渐走向临床，特异性靶向lncRNA治疗将会是一种很有前景的新方向。