宜昌绿肉猕猴桃果肉中叶绿素的结构鉴定及其抗氧化活性

(湖北省生物酵素工程技术研究中心,三峡大学食品生物技术研究中心,生物与制药学院,湖北宜昌 443002)

作为天然色素的叶绿素具有抗氧化能力,可应用于医疗、食品、化妆品等行业[1-2],近年来对植物叶片和蔬菜中叶绿素的抗氧化性研究日益增多,但对水果中的叶绿素抗氧化性研究仍然较少。研究发现,叶绿素及其衍生物都具有一定的抗氧化能力,且猕猴桃果肉中的已知的叶绿素主要有叶绿素a、叶绿素b、脱镁叶绿素a、脱镁叶绿素b、植基叶绿素a、植基叶绿素b、脱镁叶绿酸盐a[3],但其中叶绿素的种类和含量因原料的不同差异也较大[4],因此本实验在鉴定猕猴桃中叶绿素及其衍生物结构基础上,进行抗氧化性研究。其中叶绿素母系结构以叶绿素a和叶绿素b为例,分子量分别为893和907,化学结构式如图1所示[5]。

图1 叶绿素a,b的化学结构Fig.1 Chemical structure of chlorophyll a and b

DPPH·是一种稳定的自由基,在有机溶剂中呈紫色,在517 nm波长下有较大吸收,当加入抗氧化剂后一部分自由基被清除,使在该波长下吸收降低,以此来评估物质的抗氧化活性[6];Fe3+在测定化合物提供电子的情况下可被还原为Fe2+,吸光值越大还原能力越强,即物质的抗氧化性越好[7]。马惠与程茵等[8-9]都采用DPPH法与铁离子还原法进行了抗氧化性研究;马可纯[10]在研究猕猴桃复合粉抗氧化研究中,以DPPH·清除能力和还原能力结果为指标,发现华优鲜果的DPPH·清除能力和还原能力最高。

据近几年研究表明,叶绿素及其衍生物具有一定的抗氧化活性,猕猴桃果实除高含量VC和多酚等抗氧化成分外,张丽华等[11]研究了提取液的抗氧化活性,但对其内叶绿素及其衍生物的纯品没有研究。本研究以宜昌绿肉猕猴桃为原料,通过柱层析、质谱和核磁等技术,对果肉中叶绿素进行组分分析与结构鉴定,得到叶绿素单品和其降解产物,为研究猕猴桃在加工过程中的变色机理提供理论支撑,通过DPPH法和Fe3+还原力法对其单品进行了抗氧化活性研究,为今后研究其稳定性、药理性质等奠定物质基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜绿肉猕猴桃 从当地市场购买;甲醇、石油醚、三氯化铁、DPPH(2,2-二苯基-1-1苦肼基)二氯甲烷、无水乙醇、乙酸乙酯、丙酮(均为分析纯),甲醇、乙腈(均色谱纯)、氘代甲醇和氘代氯仿 天津市天力化学试剂有限公司;硅胶Gf254薄层色谱板 青岛海洋化工厂;中性氧化铝(100～200目)、D101大孔树脂 天津市恒兴化学试剂制造有限公司。

EV312旋转蒸发器 北京莱伯泰科仪器股份有限公司;UV-1800紫外可见分光光度计 岛津制作所;6210 ESI/TOF质谱仪 美国安捷伦;1200系列液相色谱仪 美国安捷伦;Bruker AVANCE III HD 400 MHz超导核磁共振谱仪 美国布鲁克·道尔顿公司(Bruker Daltonics Inc.)。

1.2 实验方法

1.2.1 猕猴桃叶绿素的制备 猕猴桃去皮打浆后,用丙酮∶甲醇体积比1∶1,液料比1.22 mL/g、提取时间236 min、提取温度59 ℃提取,提取液于4000 r/min离心10 min,分离出上层提取液(黄绿色),剩余果渣用相同的提取方法再次提取,合并两次提取液,减压浓缩后标记为脂溶性色素待测,冰箱4 ℃下密闭避光保存。剩余果渣用蒸馏水与无水乙醇体积比1∶4,液料比1.22 mL/g、提取时间236 min、提取温度59 ℃提取,提取液于4000 r/min离心10 min,分离上层提取液(黄褐色),减压浓缩后标记为水溶性色素待测[12],于冰箱4 ℃下密闭避光保存。

1.2.2 柱层析对猕猴桃色素的分离纯化

1.2.2.1 填料预处理 中性氧化铝:称取250 g,加石油醚搅拌,浸泡10 min[13];D101大孔树脂[14]:称取100 g树脂,95%乙醇浸泡24 h,充分溶胀后,用95%乙醇淋洗至流出液与水混合(1∶3)不呈白色浑浊,之后以蒸馏水洗净乙醇。

1.2.2.2 洗脱条件 用D101树脂柱分离纯化水溶性色素,各浓度均用1000 mL乙醇进行洗脱,浓度分别为20%、40%、95%,流速为1.5 mL/min,树脂分离纯化时上样量为10 mL,分离得到的不同馏分用Gf254薄层色谱板点板,展开剂为丙酮∶二氯甲烷∶甲醇3∶6∶1;用氧化铝柱分离纯化脂溶性色素,用1000 mL石油醚:丙酮混合液进行洗脱,比例分别为100%石油醚、10%、25%、50%、100%甲醇,柱层析分离纯化时上样量为15 mL,分离得到的不同馏分用Gf254薄层色谱板点板,展开剂为石油醚∶丙酮∶甲醇 8∶1∶1。

1.2.3 质谱检测 在JASCO J-815CD光谱仪上,采用0.1 cm和1 cm的石英试管,在室温下,采用100 nm/min扫描速率、2 nm分辨率和32次扫描,用干燥氮气冲洗,获得ECD光谱。样品在甲醇中以10-4mol/L或10-3mol/L的浓度溶解,并用溶剂减去光谱。

1.2.4 核磁检测 样品在Bruker AVANCE III HD 400 MHz超导核磁共振谱仪上进行测试,溶剂为氘代甲醇和氘代氯仿,1H谱的工作频率为400 MHz,脉冲序列为zg30,空扫次数(DS)为2次,采样时间(AQ)为3.985 s,采样次数(NS)为16次,增益值(RG)为101;13C谱的工作频率为100 MHz,脉冲序列为zgpg30,空扫次数(DS)为4次,采样时间(AQ)为1.363 s,采样次数(NS)为1580次,增益值(RG)为161。

1.2.5 抗氧化活性研究

1.2.5.1 提取物对DPPH·清除能力的测定准确称取冷冻干燥后的各个待测样品及VC样品50 mg,分别用溶剂溶解并定容至25 mL,配制成质量浓度为2 mg/mL溶液保存备用。

将备用溶液用蒸馏水稀释至所需的各个浓度,取3 mL各浓度样品溶液加入3 mL 0.16 mmol/L DPPH乙醇溶液于25 ℃水浴加热15 min后,在517 nm测溶液吸光度(A1),每个浓度做3个平行实验,取平均值,同时以3 mL样品中加入3 mL蒸馏水测吸光度(A2),取3 mL蒸馏水代替样品加入3 mL DPPH溶液测吸光度(A0)。以VC为对照,按下列公式计算DPPH·清除率,并计算自由基清除率IC50值[12-13]。

1.2.5.2 提取物对Fe3+还原力的测定 准确样品100 mg,溶剂溶解并定容至25 mL,配制质量浓度为4 mg/mL样品溶液,稀释成所需的不同质量浓度,取2.5 mL各浓度的样品溶液,加入2.5 mL 0.2 mol/L磷酸缓冲液和2.5 mL 1%铁氰化钾,50 ℃水浴20 min后急速冷却,加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液混匀,0.2 μm水相滤膜过滤,取上清液5 mL,加入5 mL 0.02%三氯化铁溶液混匀,10 min后在700 nm波长下测定吸光度。吸光度越大则还原能力越大,以VC作为阳性对照[14]。

1.3 数据处理

所有试验均重复3次,取平均值,实验数据采用Microcal Origin 6作图,IC50使用IC50计算器计算。

2 结果与分析

2.1 柱层析分析

通过中性氧化铝柱层析分离纯化,得到4个脂溶性色素馏分,分别为组分A1100%石油醚馏分(黄绿色)、组分B1石油醚∶甲醇10∶1馏分(橄榄绿)、组分C1石油醚∶甲醇4∶1(蓝绿色)、组分D1100% 甲醇馏分(黄绿色);通过D101树脂柱分离纯化,得到2个水溶性色素馏分,分别为组分E120%乙醇馏分(黄褐色)、组分F140%乙醇馏分(黄褐色)。其中组分C1根据文献可知为叶绿素a[15]。

2.2 质谱检测分析

图2是以组分A1、D1为例,ESI+-Q-TOF-MS测得[M+H]+的准确质量及其主要特征碎片离子m/z的图谱。最终得到物质A1的[M+H]+的准确分子质量为927.6967,与分子式C55H84O7N4相应;物质B1的[M+H]+的准确分子质量为588.4304,与分子式C34H33O5N4相应;物质D1的[M+H]+的准确分子质量为601.1116,与分子式C35H34O5N4相应;物质E1的[M+H]+的准确分子质量为927.6985,与分子式C55H84O7N4相应;物质F1的[M+H]+的准确分子质量为701.5039,与分子式C37H38O9N4相应。

图2 组分A1,D1的物质母离子的准确质量和离子组成图谱Fig.2 Accurate mass and ion composition atlas of material mother ions of components A1 and D1

2.3 核磁检测分析

图3是以A1、D1为例的1H和13C NMR谱。在13C NMR谱中,A1的δ 22.73、27.23、29.70、31.96、62.13、68.89、127.77、128.26、130.25;B1的δ 22.87、27.38、29.75、65.24、127.93、128.43、130.42、132.15、174.06;D1的δ22.85、29.49、37.93、126.84、127.38、129.75、179.07;E1的δ12.92、62.81、64.51、68.01、69.86、70.48、74.90、75.39、76.70、97.82;F1的δ61.37、61.47、64.50、68.00、70.48、74.90、76.70、97.82,与文献[16-19]中香蕉的叶绿素及降解产物核磁数据高度吻合。

图3 A1,D1的1H和13C NMR谱Fig.3 1H and 13C NMR spectra of A1 and D1

结合质谱与核磁结果,鉴定五种物质结构式如下所示(图4)。推测其中物质A1是叶绿素b在酸性条件下,中心镁离子丢失,被氢离子取代,且第Ⅱ吡咯环外的甲基氧化成羰基;物质B1是脱镁叶绿酸a副环上的羧基在酸性条件下与氢离子反应,生成羧酸;物质D1推测的结构与脱镁叶绿酸a一致,证明该组分物质为脱镁叶绿酸a。物质E1是叶绿素a的α位开环,β和δ为加上两个氧,与Vergeiner等[19]研究中的叶绿素荧光与非荧光降解产物的共同前体(epi-pfcc)结构类似,唯一区别在于物质E1的叶绿醇并未断裂,说明该物质结构是生成的降解产物共同前体反应前一步的结构,与降解过程相符合;物质F1是叶绿素a在用乙酸乙酯、甲醇和乙醇提取过程中,α位被氧化开环,叶绿醇被乙酸取代,在酸性条件下镁离子丢失,第I吡咯环外的烯基被加上了两个氧,其结构与文献[16,20]中叶绿素非荧光降解产物(Hv-NCC-1)的结构极其相似,区别在于物质F1第Ⅱ吡咯环外的甲基并未降解变化为羰基,且第Ⅳ吡咯环侧链上的丙酸与乙酸乙酯发生反应。根据此推测结果与文献进行参考,综合叶绿素稳定性因素考虑,进行叶绿素提取和分离纯化时,应在密封、pH中性等条件下进行,保障提取和纯化时叶绿素结构的稳定性,因叶绿素降解同时需要酶的参与,也可通过改变条件影响酶活,从而达到保护其结构稳定的目的[21-22]。

图4 五种物质的结构式Fig.4 Structural formulas of five kinds of substances

2.4 纯化物的抗氧化活性分析

2.4.1 纯化物对DPPH·清除作用 由图5可知,猕猴桃中各提取物对DPPH·的清除作用随纯化物质量浓度增大而增加,在所测的各提取物中,物质C1、D1、E1、F1对DPPH·清除效果较好,物质B1的清除效果稍差,在质量浓度为0.12 mg/mL时清除率为77.47%,活性最差的是物质A1,当质量浓度为0.12 mg/mL时清除率为13.97%。

图5 猕猴桃提取物对DPPH·清除率Fig.5 Scavenging rates of different solvent extracts from Kiwifruit against DPPH· free radicals

2.4.2 纯化物对DPPH·清除活性IC50值的影响 由表1可见,提取物对DPPH·清除活性IC50值的顺序为:VC<物质E1<物质C1<物质F1<物质D1<物质B1<物质A1,IC50越小说明对 DPPH·的清除效果越好,在各种提取物中C1与E1的活性最强,略低于VC,提取活性最低的是A1,为纯石油醚分离产物。

表1 猕猴桃提取物对DPPH·清除活性的IC50值Table 1 IC50 values of different solvent extracts from kiwifruit for scavenging DPPH· free radicals

2.5 提取物对Fe3+还原力的测定

由图6可知,猕猴桃中提取物对Fe3+有较强的还原能力,物质C1、E1、F1的还原能力与VC近似,物质D1的还原能力稍弱,物质A1和B1的还原能力明显弱于VC,与DPPH·清除实验结果基本一致。

图6 猕猴桃提取物对Fe3+还原力曲线Fig.6 Ferric reducing power curves of different solvent extracts from Kiwifruit

3 结论

利用溶剂提取法和柱层析等手段分离纯化得到包括叶绿素a在内的6种高纯度物质,通过质谱得到了它们[M+H]+的准确分子质量,结合核磁共振数据推测了5种叶绿素相关物质的结构。其中C1为叶绿素a,得到物质A1的[M+H]+的分子质量为927.6967,分子式为C55H84O7N4;物质B1的[M+H]+的分子质量为588.4304,分子式C34H33O5N4;物质D1的[M+H]+的分子质量为601.1116,分子式为C35H34O5N4,推测结构可知为脱镁叶绿酸a;物质E1的[M+H]+的分子质量为927.6985,分子式C55H84O7N4;物质F1的[M+H]+的分子质量为701.5039,分子式C37H38O9N4。同时通过DPPH法和Fe3+还原力法对其单品进行了抗氧化活性研究,结果显示E1与F1的活性最强,在质量浓度为0.12 mg/mL时,DPPH·清除率分别为93.14%和93.39%,略低于VC的96.49%;在质量浓度为1.0 mg/mL时,物质E1与F1的吸光值均为1.92,仅次于VC的1.95,说明抗氧化性强,与清除实验结果相吻合。