晚期糖基化终产物对糖尿病及其并发症的影响和干预的研究进展

2019-02-19郑晓茂综述李超英审校

重庆医学 2019年13期

郑晓茂，茹琴，陈琳综述，李超英审校

(江汉大学武汉生物医学研究院，武汉 430056)

晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGEs)由法国生物化学家美拉德于1912年将甘氨酸和葡萄糖混合一起加热时发现，故此反应又称为Maillard反应[1]。AGEs是指果糖、葡萄糖等还原糖的醛基和蛋白质、核酸、氨基酸等大分子物质的氨基，在非酶促条件下经过一系列复杂的反应后形成稳定的不可逆的终末产物。AGEs在体内多种细胞和组织器官中蓄积，进而诱导氧化应激和炎性反应，是参与糖尿病及其并发症发生、发展的主要机制。研究证明，AGEs对胰岛β细胞具有比高糖更强、作用时间更久的毒性作用，是糖尿病及其并发症持续恶化的重要因素[2]。本文就AGEs形成、检测、致病机制和干预物质的研究进展进行综述。

1 AGEs的形成与检测

AGEs的生成可分为三步[3]：(1)氨基酸、蛋白质类大分子物质末端的还原氨基和葡萄糖上的醛基在非酶条件下反应形成席夫碱，反应迅速且可逆程度高；(2)希夫碱不稳定，经过一段短暂的时间后，自发重排形成相对稳定的酮胺类化合物(Amadori产物)，反应相对缓慢并可逆，上述反应生成的产物统称为早期糖基化终末产物；(3)Amadori产物进一步降解、重排形成羰基化合物，接着羰基化合物与蛋白质上的自由氨基反应生成AGEs，此步反应生成的产物非常稳定且不可逆。人体内AGEs的来源主要有两个方面：(1)体内发生非酶糖基化反应，即个体在新陈代谢过程中发生糖基化反应生成一定量的AGEs，而持续高血糖条件下极大的加速了AGEs的生成；(2)除了在体内形成，AGEs也可以通过饮食在人体内蓄积，尤其是烧烤、油炸等方式加工的食品，AGEs含量很高，外源性AGEs已经成为人体内AGEs沉积的重要来源。

AGEs结构复杂且呈异质性，检测AGEs的主要方法有[4]：(1)AGEs具有荧光特性，因此可以通过测定荧光值来间接反映AGEs水平，荧光光谱法迅速简便且灵敏度高，是目前检测AGEs较为常用的方法；(2)高效液相色谱法的优点是效率高、灵敏度高、分辨率高，缺点是操作过程繁琐、成本高，不利于普及；(3)酶联免疫吸附剂测定法也是检测AGEs常用的方法，具有灵敏度高、特异性强的特点，但该法对操作的要求较为严格，有时需要多次重复，比较费时费力。

在临床检测指标与方法的研究探索中，目前一致认为测定早期糖基化终末产物例如糖化血红蛋白水平，是评估糖尿病患者8～12周血糖控制情况的金标准。鉴于糖化血红蛋白的寿命在120 d左右，有研究表明与糖化血红蛋白相比，测定AGEs水平可反映更长时间的血糖水平控制情况[5]。通过高效液相色谱法检测糖尿病患者血清和晶状体蛋白中的AGEs，发现糖尿病患者体内的AGEs显著高于非糖尿病受试者[6]。还有研究发现，利用AGEs具有荧光的特性，通过无创荧光光谱法检测皮肤中AGEs水平可以反映人体内AGEs总体水平[4]，此方法具有快速无创的优点，且具有更高的灵敏度，可用于糖尿病的筛查，且优于检测空腹血糖和糖化血红蛋白，具有一定的应用前景。

2 AGEs的致病机制

研究表明，AGEs参与的疾病包括糖尿病、动脉粥样硬化、视网膜病变、阿尔茨海默病、尿毒症、白内障等[7]。已有研究证明，AGEs对胰岛β细胞的毒性作用比高糖更强、作用时间更久，是参与糖尿病发生、发展和持续恶化的主要因素之一[2]。AGEs作为糖尿病的致病因子是导致糖尿病并发症发生、发展的重要因素[8]，AGEs参与糖尿病及其并发症主要通过以下几个方面。

2.1AGEs和蛋白质交联 AGEs修饰蛋白质影响其结构和功能特性。AGEs通过分子间的共价键与机体内的蛋白质交联或结合，改变蛋白质的生物特性，从而引起生理生化性质的变化[9-10]。如AGEs与Ⅰ型胶原蛋白及弹性蛋白发生交联，导致细胞外基质面积增大，造成血管硬度增加[11]。胶原蛋白和层粘连蛋白是基底膜中的关键蛋白，当AGEs在肾脏中蓄积后，胞外基质Ⅳ型胶原分子之间的结合能力降低，破坏空间支架结构，同时层粘连蛋白本身的多聚性降低，与Ⅳ型胶原分子连接性减少，肾小球基底膜支架结构孔径增大，通透性增加，从而导致蛋白尿和糖尿病肾病[12]。SINGH等[13]发现，AGEs在作用于基质蛋白后可以改变其结构和生物学特性，导致机体功能性损伤，如血管增厚、弹性降低和血管内皮功能障碍等。

2.2AGEs与其特异受体(receptor of advanced glycation end products，RAGE)结合 RAGE在多种类型的细胞上均有表达，如内皮细胞、平滑肌细胞、神经细胞、神经胶质细胞、单核细胞/巨噬细胞、成纤维细胞等[14]。AGEs与RAGE相互作用后激活一系列复杂的信号转导通路，包括ERK1/2MAPK、JAK/STAT、SAPK/JNK、MAPK、AKT、caspase-3/7和TGF-β-Smad，诱导许多细胞内信号传导通路产生活性氧和活性氮，从而进一步导致不同的病理反应[15]。免疫组织化学染色法检测RAGE在糖尿病肾病患者肾小球中的水平，结果在肾小球系膜细胞及上皮细胞中均有明显的阳性染色，而对照样品中未检测到RAGE的表达[12]。RAMASAMY等[16]发现高糖血症中RAGE的上调导致体内AGEs的加速积累，并且AGE-RAGE信号转导通路与糖尿病血管并发症的进展密切相关。ZHU等[2]发现，AGEs通过和RAGE相互作用，引发一系列氧化应激、炎症等级联反应，最终导致糖尿病及其并发症的发生。AGEs可以调节和增加RAGE的表达，健康人群的RAGE表达水平很低，当AGEs与RAGE结合后，诱导的氧化应激和炎性反应增多，导致RAGE的表达增加。

2.3AGEs对胰岛β细胞的直接损伤作用近年的研究发现，AGEs对胰岛β细胞具有直接损伤作用。CAI等[17]通过给予小鼠长期摄入AGEs，结果发现小鼠表现出明显的肥胖和胰岛素抵抗。腺苷三磷酸(ATP)在胰岛素分泌中发挥重要作用，当体内ATP含量降低时，胰岛素分泌将会受到抑制。ZHAO等[18]在分离的小鼠原代胰岛β细胞中发现，AGEs通过阻断细胞色素C的氧化，降低ATP的合成，从而影响胰岛β细胞分泌胰岛素。LIM等[19]报道，AGEs通过诱导活性氧的产生和增加RAGE的表达，促进胰岛β细胞凋亡，而通过减少活性氧的产生和抑制RAGE能够明显减少细胞凋亡。此外还有研究报道，AGEs通过激活caspase-9和抑制抗凋亡基因Bcl-2的表达，同时引起线粒体肿胀，促进胰岛β细胞凋亡[20-21]。这些报道都证明了AGEs可以直接作用于胰岛β细胞，诱导胰岛β细胞发生氧化应激反应，导致胰岛素合成与分泌功能障碍，促使胰岛β细胞凋亡。

3 AGEs的干预

AGEs在糖尿病的发生、发展过程中起着重要的作用，通过抑制或裂解AGEs，阻断AGEs与RAGE的结合，以减轻其进一步诱导的氧化应激等级联反应，是目前保护胰岛β细胞及降低糖尿病患者并发症发生的重要手段。

3.1抑制AGEs的生成氨基胍作为亲核肼化物被广泛地应用于抑制AGEs的形成，其主要是通过阻断Amadori产物进一步形成羰基化合物，从而抑制AGEs的形成[22-24]。在体外非酶糖基化反应体系中加入200 mmol/L氨基胍后，AGEs生成明显受到抑制，并且随着时间的推移，抑制率最高达到84.26%[25]。但是临床试验发现氨基胍具有明显的不良反应，目前无法继续应用于临床。另一个研究较多的是吡哆胺，吡哆胺是一种亲核试剂，能够清除非酶糖基化和脂质过氧化过程中产生的活性羰基化合物，抑制糖基化中间产物转变为AGEs，同时减少氧化应激反应[26-27]。给予糖尿病大鼠吡哆胺灌胃12周，结果发现糖尿病大鼠视皮质中AGEs水平明显降低，RAGE的表达明显受到抑制[28]。吡多胺对人体无明显的不良反应，具有良好的应用前景，但是吡哆胺抑制AGEs的相关研究还相对较少，且对AGEs的最佳抑制浓度还需进一步探讨。此外，二甲双胍、阿卡波糖和维生素C等临床药物也被发现对AGEs具有一定的抑制作用。

3.2AGEs裂解剂另外一种AGEs的干预手段是加入裂解剂裂解或断裂AGEs，其优势在于可以逆转已生成的AGEs及其交联结构。如N-苯乙酰噻唑(PTB)，已被证实可以有效地裂解体外已形成的AGEs，但是PTB化学性质不稳定，容易发生水解而失去药理作用[29]。4，5-二甲基-3-苯乙酰噻唑氯(ALT711)是由美国Alteon公司开发的一种AGEs及其交联结构裂解剂，在Ⅰ、Ⅱ的期临床试验中，ALT711均表现出了对糖尿病及其慢性并发症有良好的治疗效果，但是由于经济问题Alteon公司已停止了ALT711的临床试验。

3.3阻断AGEs与RAGE的结合 RAGE是AGEs信号转导通路的主要受体，AGEs-RAGE信号转导通路激活后，诱导炎症因子的释放及氧化应激反应的发生，从而导致了糖尿病及其并发症的发生、发展。因此阻断AGEs和RAGE的结合是一个新型治疗靶点。目前研究较多的是可溶性sRAGE及抗RAGE抗体。sRAGE由RAGE的胞外域直接脱落而成，能够竞争性的与体内AGEs结合，阻断了AGEs与RAGE结合引起的细胞内信号传导通路。糖尿病小鼠经sRAGE治疗后，蛋白尿明显降低，动脉粥样硬化及肾小球硬化明显改善[30]。抗RAGE抗体是通过与RAGE胞外区域相互作用，阻断AGEs-RAGE信号通路诱导的生物学效应[31]。给予抗RAGE抗体治疗糖尿病小鼠，超声测量小鼠后肢血流情况，发现抗RAGE抗体治疗组小鼠血管成像信号明显高于对照组，证明抗RAGE抗体对糖尿病足病具有良好的治疗效果[32]。

3.4通过阻断氧化应激间接抑制AGEs的作用通过降低氧化应激来保持体内自由基的稳态是治疗AGEs诱导的糖尿病及其并发症的另一个治疗方向[33]。用二甲双胍干预AGEs损伤的大鼠成骨细胞，实验结果表明二甲双胍呈剂量依赖性的减少成骨细胞的氧化应激反应及凋亡，对大鼠成骨细胞具有明显的保护作用[34]。替莫普利和奥美沙坦干预AGE-BSA处理的兔主动脉平滑肌细胞，与模型组相比，二者均能够明显降低细胞的氧化应激反应，减少细胞凋亡，对细胞具有明显的保护作用[35]。吡哆胺已被证明能有效抑制AGEs的产生，其作用机制就是通过清除非酶糖基化和脂质过氧化过程中产生的活性羰基化合物，抑制AGEs生成的同时减少了氧化应激反应的发生，从而对机体具有良好的保护作用[27]。

除上述药物外，目前开发的针对AGEs的药物还有Glycadia公司的GLY-230和同和药业有限公司的DW-1029M，这两种药物均处于临床Ⅱ期试验阶段，未来有望用于治疗以AGEs为靶点的相关疾病。然而，现在进入临床的AGEs靶点药物仍比较有限，因此需要深入研究其作用机制以利于开发新药物。

4 天然产物对AGEs的干预

已有研究表明，某些天然产物或其活性成分对AGEs的生成具有明显的抑制作用，如具有抗氧化抗炎作用的黄酮类化合物，对AGEs的生成也展现出了明显的抑制效果[25]。如槲皮素，体外和体内实验中均证明能够有效地减少AGEs的生成及蓄积，尤其是在体外非酶糖基化实验中发现槲皮素对AGEs的抑制作用明显强于氨基胍[36]。此外，还有实验证明多种植物提取物的多糖对AGEs的生成也有抑制作用，如绿茶和芦荟多糖提取物已被证明能够明显抑制对AGEs的生成，且二者对AGEs的作用时间越长，抑制率越高[37]。

另一类研究较多的是多酚类化合物，如白藜芦醇，体外非酶糖基化体系研究发现600 μg/mL白藜芦醇几乎完全抑制了AGEs的生成[38]。采用体外制备的AGEs建立人脐静脉内皮细胞损伤模型给予白藜芦醇干预后，发现白藜芦醇能够明显抑制细胞色素C的释放和细胞caspase-3的活性，明显降低了AGEs介导的内皮细胞损伤[39]。ZHANG等[40]用100 mg/L的AGEs和10 μmol/L白藜芦醇同时干预巨噬细胞24 h，与模型组比发现，白藜芦醇能够明显抑制细胞内RAGE的表达，降低了AGEs-RAGE信号通路激活引起的细胞损伤。在2型糖尿病大鼠动物模型中给予白藜芦醇灌胃30 d，结果发现10 mg·kg-1·d-1剂量的白藜芦醇能够明显降低糖尿病大鼠体内丙二醛、血糖、RAGE水平，明显提高总抗氧化能力和胰岛素水平[41]，表明白藜芦醇通过降低氧化应激和下调RAGE的表达对糖尿病大鼠具有保护作用。