布鲁氏菌鞭毛研究进展

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布鲁氏菌是一种兼性胞内病原体，能够引发人畜共患病-布鲁氏菌病，因为布鲁氏菌具有高度的传染性，能够通过空气进入呼吸道传播，且初始症状容易与流行性感冒相混淆，是潜在的生化武器，被我国列为乙类传染病。自上世纪90年代以后，由于多种因素的影响，我国布鲁氏菌病呈现出明显上升的发病趋势，流行范围呈现明显的扩散趋势[1]，探究布鲁氏菌毒力机制，研发布鲁氏菌人畜疫苗是未来的研究重点[2]。布鲁氏菌之前被认为无鞭毛，直到近几年电镜技术的发展才确定它的存在，并已有一些研究证实其有构成布鲁氏菌毒力，作为疫苗候选的潜在可能性。

布鲁氏菌病发病机制主要与布鲁氏菌入侵宿主细胞并在其胞内存活和复制有关[3-4]。在布鲁氏菌侵入宿主细胞并在宿主细胞内生存繁殖的过程中，多种毒力因子相互协调发挥保护细菌免受机体免疫系统杀伤的作用，布鲁氏菌鞭毛在其中发挥的作用值得进一步的研究。

1 布鲁氏菌鞭毛的发现

细菌的鞭毛是从菌体伸出的细长的丝状物。它使细菌能更好地适应环境，是细菌在进化过程中长期适应的结果。它既是一个运动器官，又是一个蛋白质转运/组装装置。它由3个部分组成，包括基体(Basal body)、钩型鞘(Hook)和鞭毛丝(Flagellar filament)[5]。

关于鞭毛的研究通常建立在细菌运动性的基础上，而布鲁氏菌并无运动特征也是布鲁氏菌一直以来被认为无鞭毛的原因之一。1998年Halling发现牛种布氏菌含有几种鞭毛相关蛋白同源物的开放阅读框[6]，2002年DelVecchio和Paulsen等人的研究发现布鲁氏菌具有趋化基因外所有鞭毛结构基因，组成3个基因座，并与苜蓿中华根瘤菌具有广泛的基因同源性[7-8]，这些基因位于小染色体上。

2005年D.Fretin等人一方面构建了包含鞭毛基因fliF启动子的质粒，通过β-半乳糖苷酶测定法验证布鲁氏菌侵染巨噬细胞过程中鞭毛基因fliF基因的瞬时表达；另一方面对从羊种布氏菌获得的全细胞提取物进行蛋白质印迹分析，在布鲁氏菌指数增长期早期检测到布鲁氏菌鞭毛钩蛋白fliE和鞭毛蛋白fliC的表达[9]。从这两方面可以看出布鲁氏菌鞭毛基因、蛋白质或鞭毛器并非不表达，其表达依赖于生长期，透射电镜下观察其鞭毛属单一极性鞭毛，同副溶血弧菌一样在鞭毛表面包裹着一层鞘膜，有研究发现此鞭毛与布鲁氏菌毒力相关，并在布鲁氏菌持续感染中有不可或缺的意义[10-11]。

2 布鲁氏菌鞭毛染色及镜下观察

作为细菌的运动器官，鞭毛的数量、形态和它在菌体的分布位置是鉴定细菌的重要指标，但由于它的直径非常纤细，必须采用特殊的染色方法才能在显微镜下观察到。常见的细菌鞭毛染色方法包括赖夫生染色法、西萨-基尔染色法、银盐染色法、柯达卡溶液染色法及负染法。需要注意的是：布鲁氏菌仅在早期指数生长期才能观察到鞭毛，并且对培养基的营养需求较高(国外研究证实在2YT培养基中培养可实现)[12]。

根据报道，Ryu染色法可观察到布鲁氏菌鞭毛。方法如下：将10 mL 5%苯酚水溶液、2 g单宁酸和10 mL饱和硫酸铝钾-12水合物制成媒染剂；将结晶紫的饱和乙醇溶液(25 g 95%乙醇中的3 g)制成染色剂；之后将媒染剂与染色剂以1∶10混合并过滤得到最终的RYU着色剂；将1滴细胞培养物转移到载玻片上，盖上盖玻片；5～10 min后将2滴Ryu染色剂施加到盖玻片的边缘通过毛细管作用流动到盖玻片下面并与细胞悬液混合；室温5～10 min后在相差显微镜下观察细菌鞭毛[12-13]。相差显微镜下结果见图1[12]。

图1 布鲁氏菌及其鞭毛相差显微镜结果Fig.1 Brucella and its flagella under the phase-contrast microscopy

透射电子显微镜(TEM)能看到光学显微镜下无法看清的结构(亚显微结构)，适合布鲁氏菌鞭毛观察，观察方法如下：细菌在37 ℃的丰富培养基培养至OD600nm处为0.25的状态，1 000 r/min离心20 min，得沉淀用PBS悬浮，之后应用醋酸铀负染法于透射电镜下观察。透射电镜镜下结果见图2[12]。

图2 布鲁氏菌及其鞭毛电子显微镜结果Fig.2 Brucella and its flagella under the transmission electron microscopy

3 布鲁氏菌鞭毛基因测序及其表达调控

经基因组测序发现，布鲁氏菌具有除趋化基因外所有鞭毛结构基因，并被认为属于隐性遗传物。不同布鲁氏菌属的几种鞭毛基因中存在变异，将对揭示布鲁氏菌遗传进化过程有指导作用[14-16]。

在2005年D.Fretin等人的研究发现布鲁氏菌鞭毛基因在早期生长指数期可以表达，并通过透射电子显微镜TEM观察到由LPS轴承护套包围的完整极性鞭毛结构[9]。多种基因参与布鲁氏菌鞭毛生成。在2007年S.Leonard和J.Ferooz等人的研究中羊种布鲁氏菌ftcR作为鞭毛的主调节因子发挥作用，是vjbR调节鞭毛系统的中间环节，ftcR具有双组份响应调节结构域以及DNA结合结构域，并被编码在羊种布鲁氏菌的第一鞭毛位点，在ftcR失活的情况会导致鞭毛基因表达下降和布鲁氏菌毒力受损[17]。在之后2011年J.Ferooz验证了fibT基因在鞭毛蛋白flic生成中的作用。而sigma因子rpoE1的突变则会引起鞭毛基因fliF,flgE,fliC,flaF和fibT的过表达，与鞭毛长丝的产生相关，验证了rpoE是一个鞭毛阻遏基因。而rpoE1的突变会增加鞭毛主调节因子ftcR的启动子活性。这表明rpoE1上层调控ftcR[18]。鞭毛表达受一系列基因调控，具有复杂的调节机制。

4 布鲁氏菌鞭毛与毒力

常规认为鞭毛及其运动功能可促进细菌对于宿主细胞的黏附与侵袭，在细菌生物被膜形成过程中起重要作用，与细菌毒力因子的分泌也密切相关。有研究表明费氏弧菌可通过鞭毛的旋转调节外膜蛋白释放，从而影响毒力[19]。布鲁氏菌与费氏弧菌皆为单极鞘鞭毛，有一定的参考价值。另外布鲁氏菌毒力的一个重要方面是其在感染细胞内的存活，复制和持续的能力。当前对布鲁氏菌鞭毛毒力的探索建立在细胞实验和动物实验之上。在体外实验层面，D.Fretin等人构建鞭毛基因突变体，并与野毒株共同侵袭细胞，比较其细胞侵袭及胞内复制的能力，观察一定时间后菌落形成单位结果显示无明显差别；2013年Matthieu Terwagne等人的研究显示同样的结果[10]。

在动物实验层面，D.Fretin等人研究显示布鲁氏菌鞭毛突变体在小鼠中减毒，通过构建鞭毛基因突变体，并与亲本株一起感染小鼠感染初期无明显差别，感染后期感染突变体小鼠平均脾重显著低于亲本株感染小鼠，提示羊种布氏菌在小鼠中的持续感染需要鞭毛结构的表达[9]。而Matthieu Terwagne等人的研究显示过表达鞭毛蛋白fliC菌株在小鼠中减毒，同样条件fliC缺失株增强了羊种16M菌株在体内毒力的持续性。

布鲁氏菌鞭毛蛋白对毒力的影响较为复杂，尚需进一步的研究。

5 布鲁氏菌鞭毛与免疫“逃避”策略

有研究表明，布鲁氏菌使用被动以及主动机制来逃避先天性免疫系统的TLR检测。布鲁氏菌鞭毛蛋白TLR5活性的缺乏以及其对宿主细胞的合成或递送的调节都是布鲁氏菌对先天免疫系统的隐身策略的一部分[10]。尽管鞭毛蛋白逃避TLR5的检测，但仍可引起胞质模式识别受体PRRs的检测进而启动免疫应答。鞭毛蛋白引起的固有免疫可以破坏布鲁氏菌进入宿主时的“隐身”能力，在这种情况下，鞭毛蛋白可被认为是“宿主保护因子”[20]。

实际上，布鲁氏菌对于宿主免疫系统来说并非完全不可见，它们仍然可以检测到它们并形成TH1应答来控制感染。然而，宿主免疫应答不足以消除细菌，导致以病原体毒力和宿主抗性之间的平衡为特征的慢性感染状态。TLR5和NLRC4/NAIP5复合物被视为目前唯一胞外/胞质细菌鞭毛蛋白先天免疫传感器的蛋白质。通过逃避TLR5介导的检测，布鲁氏菌获得一定程度的“隐身”。布鲁氏菌fliC是第一个发现以NLRC4独立方式体外诱导巨噬细胞分泌IL-1β的鞭毛蛋白。通过鞭毛蛋白激活先天性免疫途径来限制体内布鲁氏菌的复制将成为应对布鲁氏菌病的一种新方法。

6 布鲁氏菌鞭毛免疫原性与群体感应

鞭毛蛋白作为革兰氏阴性菌的主要结构蛋白，是TLR5的配体和寡聚核酸区域(NOR)末梢感受器(NLR)家族的固有感受器。当它通过不同方式以共价键与抗原结合时展现出强大的免疫原性[19]。因此，鞭毛蛋白已经作为疫苗研制的新平台成功应用于各类菌株。例如幽门螺杆菌、爱德华氏菌等多种病菌[20-21]。鞭毛蛋白可作为各种细胞类型先天和适应性免疫的有效激活剂。有研究证明布鲁氏菌鞭毛蛋白有着促进一系列先天细胞免疫类型的细胞因子产生的能力。2012年研究发现在其检测范围内，5种布鲁氏菌鞭毛蛋白可刺激来自S19免疫小鼠的脾细胞中显着更高水平的IFN-γ分泌，表明其具有T细胞诱导活性。

细菌通过群体感应系统自发产生、释放一些特定的信号分子，并能感知其浓度变化，调节微生物的群体行为。虽然每种革兰氏阴性菌所产生的的群体感应机制不同，但其调控蛋白具有高度同源性，目前研究到大多数革兰氏阴性菌都存在名为LuxI-AHL型的群体感应系统，有研究证明布鲁氏菌鞭毛基因作为布鲁氏菌潜在毒力因子，受群体感应系统调控。VjbR是LuxR家族的群体感应调节因子，可以调节fliF和figE基因的表达[11, 22]。

7 布鲁氏菌鞭毛蛋白展望

通过构建鞭毛蛋白和保护性抗原结合后的融合蛋白，由此方法已经产生许多证明有效的动物疫苗。布鲁氏菌鞭毛蛋白具有一定免疫原性，已有研究证明其通过添加佐剂可作为布氏菌病疫苗候选[21, 23]，但要注意鞭毛蛋白融合蛋白的长期储存可能导致形成以TLR5非依赖性方式起作用的大聚集体，类似动态光散射的方法是确保鞭毛蛋白和鞭毛蛋白融合蛋白是单体且不聚集的有效手段[24]。

目前对布鲁氏菌鞭毛蛋白的研究尚处于初级阶段，其出现的确切时条件，对布氏菌隐身策略乃至毒力的影响等方面尚无定论，而其在毒力探索及疫苗研制方面所起的作用确有研究价值，值得进一步的研究。

利益冲突：无