华支睾吸虫生活史室内微生态建立

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华支睾吸虫(Clonorchissinensis，肝吸虫)感染人主要引起肝胆系统长期慢性炎症反应，严重可致肝纤维化和胆管癌。WHO国际癌症研究署于2009年已将华支睾吸虫确定为胆管细胞癌明确致癌物[1]。我国是肝吸虫病主要流行区，而广西肝吸虫感染率位居全国第二位[2]，近年感染率一直呈上升趋势[3]，肝吸虫感染已成为影响广西公共卫生健康的重要寄生虫病。

肝吸虫生活史复杂，需要水环境，人是终宿主，主要保虫宿主有猫、犬、鼠等，第一中间宿主为淡水螺类，主要有纹沼螺(Parafossarulusstriatulus)、长角涵螺(Alocinmalongicornis)和赤豆螺(Bithyniafuch-sianus)；第二中间宿主主要是鲤科鱼类。而野生麦穗鱼(Pseudorasboraparva)对肝吸虫有很高易感性，常作为获取囊蚴的供体。但若完全依靠从流行区采集麦穗鱼和淡水螺来获取实验所需囊蚴和尾蚴，不可避免会受到季节、气候、人力等储多因素限制，从而影响工作的时效性和计划性，而野外获得的鱼往往还合并感染有其它囊蚴，这又极大地增加了分离鉴定囊蚴的工作量。为满足科研和教学工作的需求，有必要建立一个小型室内华支睾吸虫生活史的生态环境来解决样本的来源问题。经过三年摸索和改进，现已成功构建了一个能完成肝吸虫生活史的生态环境。该生态占地面积小，日常维护所需人力物力少，可行性高，现将方法报道如下。

1 材料与方法

1.1实验动物来源 纹沼螺、麦穗鱼分别采自广西肝吸虫流行区横县水库和沟渠；雌性SD大鼠(SPF级)，160～180 g，购自本校实验动物中心。

1.2麦穗鱼饲养缸和纹沼螺饲养盆的建立和管理 取塘泥晒干备用。玻璃鱼缸大小120 cm×60 cm×50 cm，分隔成3个区间，左、右两边宽20 cm，中间宽80 cm，水深40 cm，底部铺塘泥厚约10 cm，种植水韭草(Valisneriaspiralis)；纹沼螺饲养盆为长方形塑料盆，2个，可直接从市场购买，大小66 cm×40 cm×18 cm，塘泥放于盆的短边端，约占盆长度一半，厚8 cm，同样种植水韭草，水深16 cm；另订做一隔网，长度与盆宽度等长，宽度等同于盆高度，插在盆的底部无塘泥这端，隔出一空间用于饲养已感染的麦穗鱼。24 h充氧和抽水循环，12h全光谱灯光照；在水温低于20 ℃时，开启加热棒，维持水温在24～25 ℃；每周投喂小鱼饲料(市售)2～3次，每2周换水1/2，所用水为自来水，使用前先将自来水接入缸内存放3～4 d以去氯后使用。

1.3肝吸虫虫卵收集 收集肝吸虫感染者粪便，采用水洗沉淀法处理后，留取沉渣。

1.4纹沼螺感染及查尾蚴 将上述收集的沉渣倒入直径15 cm培养皿内，然后放入纹沼螺963个， 螺与虫卵比例约1∶50，保持水面没过螺即可，感染8 h，之后将螺连同皿内沉渣一起倒入饲养盆内，每周重复1次，连续3次。查螺时先将30个螺放入直径6 cm平皿内，加入清水置灯下光照，查到有尾蚴时，再将螺移入直径3.5 cm小培养皿内，一螺一皿，便可将阳性螺鉴定出来。阳性螺移入另一饲养盆内，与未受染螺分开饲养。

1.5麦穗鱼感染 早上8点，取阳性螺1螺1皿，加入清水，置灯下光照，下午3点，将阳性螺放回池内。尾蚴连同皿内的水一起倒入2 000 mL烧杯内，加清水至1 000 mL刻度处，打开气泵，调节气量适中，放入麦穗鱼，加盖以防鱼跃出，过夜。第2 d将鱼连同水一起倒入饲养阳性螺的盆内隔出的养鱼区间。为避免一次大量感染可能会造成鱼死亡，采用单次感染的尾蚴数量每尾鱼不超过3千条，隔天或每天连续感染，累积感染尾蚴总数1～2万条。之后鱼可在隔间内饲养，或移到鱼缸小池内与未感染鱼分开饲养，便于使用时捞捕。

1.6囊蚴活力鉴定和大鼠感染 采用人工消化法收集囊蚴。人工消化液配制： 0.9 g NaCl溶于100 mL单蒸水中，再加入1 mL浓盐酸，混匀，最后加入0.6 g胃蛋白酶，搅拌至完全溶解。取麦穗鱼，去除鱼鳞、鱼鳍和内脏，鱼肉细细剁碎，移入三角烧杯内，按鱼肉与消化液1∶10(g/mL)比例倒入人工消化液，37 ℃，慢摇消化过夜。过滤去渣，滤液倒入沉淀杯内进行水洗沉淀，反复3～5次直至上层清澈，倒掉上清液，留取沉渣置平皿内，镜下分离囊蚴。随机取100个囊蚴，加入0.1%胰酶，镜下观察计数3 min内脱囊数。用灌胃针经口感染10只SD大鼠，每鼠100个囊蚴，感染后第20 d开始取粪便查虫卵，第50 d杀鼠计数胆管内成虫。

2 结 果

2.1纹绍螺饲养及感染情况 2016年5月建成如图1所示纹绍螺饲养盆，麦穗鱼可饲养在放置抽水泵的这个隔间，便于捕捞，也不影响尾蚴与鱼接触。饲养阴性螺的盆则无需加此隔层。8月放入从流行区采集的963个纹绍螺，在1个月内经反复查螺确认无逸肝吸虫尾蚴后进行虫卵感染螺实验，于12月开始陆续查到阳性螺，至次年5月共计47个，感染率约4.9%(47/963)。每次逸出的尾蚴数量不定，有时多达数千条，有时仅数十条，没有规律可循。螺饲养至第2个月即观察到有少量幼螺，全年都有产卵孵化幼螺行为。

2.2麦穗鱼饲养和感染情况 2014年5月先建成鱼缸，10月放入麦穗鱼48条，开始半年，每月有1～2条鱼死亡，之后稳定，极少死亡。第2年6月观察到有小鱼出生，鱼群数量维持在40条左右(图2)。单独观察了3条麦穗鱼最后形成的囊蚴数与用于感染的尾蚴总数之比，分别是30.93%(928/3 000)、27.95%(1677/6 000)、32.35%(2912/9 000)，平均30.65%。麦穗鱼体内囊蚴数量达8千至1万时，鱼仍能正常存活。随机取100个囊蚴，加入0.1%胰酶，均能在3分钟内脱囊，显示囊蚴的活力很好。SD大鼠于感染后第23 d首次查见虫卵，第28 d全部查到虫卵，第50 d杀鼠获得成虫数为57.8±17.1条。

图1 纹沼螺饲养盆Fig.1 Basin for breeding Parafossarulus striatulus

图2 麦穗鱼饲养缸Fig.2 Aquarium for breeding Pseudorasbora parva

3 讨 论

麦穗鱼体形小，喜浅水，养殖时不需要提供大体积水体，极大节省空间。该鱼虽为野生，但较易训化为室内养殖，从目前来看其寿命至少有3年以上，最重要的是对肝吸虫囊蚴高度易感且耐受性高，囊蚴达数千至上万仍不会致死，极适合用做肝吸虫生活史生态池中第二中间宿主的动物模型。我们在横县流行区采集的螺以纹沼螺占大多数，豆螺数量较少。

曾将几十个豆螺放在盆内饲养，养殖条件与纹沼螺相同，但未能繁殖起来。纹沼螺寿命1年半左右，当年下半年采集回来的成螺或老螺，养至次年下半年大部分螺包括阳性螺都将陆续死亡，因此用虫卵感染螺的工作每年都需要做，用以补充死掉的阳性螺。如果螺的繁殖数量不够多，还是需要从野外采集部分回来补充。

梁炽[4]报道的饲养池占地面积大，日常维护所需工作量也大，不易做成；程荣联[5]报道的是一个建于楼顶户外型饲养池，受季节影响，不适合冬季时间长，气温寒冷地区。本次建立的生态环境为室内，占地极小，放在实验室角落即可，日常维护所需工作量不多，冬季通过加热棒加温，可不受季节影响。

不同于上述梁和程的报道，本模式将螺与鱼分开饲养，螺另置于一小水体饲养，除了便于对螺进行观察和操作外，还能避开鱼和螺共养时带来的鱼对螺的攻击。为提高虫卵感染纹沼螺和尾蚴感染鱼的感染效率，不能完全依赖在饲养环境中的自然感染，通过一些人为操作来增加螺吞食虫卵和尾蚴接触鱼的机会也是需要的。本模式中螺感染率约为4.9%，离我们的预期还是有一定差距，如何提高螺感染率又不增加其死亡，还需要进一步探索。

利益冲突：无